导图社区 核酸检测
这是一篇关于核酸检测的思维导图，主要内容包括：四、检测，三、纯化，二、分离提取，一、样本前处理。
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核酸检测
一、样本前处理
样本的灭活
对送检样本进行56°C下30分钟灭活，采用水浴或空气加热形式完成灭活·采用空气加热时可适当延长灭活时间。
样本的处理
体液标本
按水样标本的方式离心后取沉淀,提取核酸
痰液标本
含蛋白质与其他杂质，使用lmol/NaOH或变性剂夜化。
组织标本
新鲜组织块:置于液氮中研磨捣碎使其彻底匀浆化，再用蛋白酶K 消化后提取核酸·
石蜡切片:二甲苯脱蜡·浸泡于主机降低乙醒溶液中复水，蛋白酶K消化
细胞标本
贴壁生长细胞:025%或0.05%胰酶消化+离心收集再将细胞重是于PBS中漂洗离心收集。
非贴壁生长细胞:离心收集,再将细胞重县于PBS中漂洗离心收集。
棉拭子
将已采样的棉拭子置于等渗的缓冲液中,充分振荡洗涤后，在室温下静置5~10分钟,待大块状物下沉后，取上清液立即离心。
血液标本
全血抗疑剂:EDTA 枸酸钠
血清，血浆·外周血单个核细胞抗凝剂:肝素
处理原则
标本采集的时间和注意事项
在感染性疾病的发生发展过程中,病原体数量会在变化，以至于在某个时间段会出假阴性的检测 结果。
标本的类型和数量标本的采集
根据不同类型的疾病病程的不同阶段以及检测方法的要求等，收集相应的临床标本
标本采集部位的准备
对采集部位进行清洁消毒,去掉污染的微生物等，但不应去掉或破坏目的检测物。
标本的运送
建议大多数的临床样本在采集后，尽可能都在2~8”C低温运送。
标本的保存
对不能及时检测的样本其中用于DNA检测的样本可在2~8C保存一周·而用于RNA 和蛋白质检测的样本，短期冻存可在-20%C，长期保存需置于-70°C以下或液气中。
标本处理中的生物安全问题
按照相关生物安全制度和操作程序进行
二、分离提取
核酸的定量和保存
DNA的保存
-20度或-70度，TE缓冲液中可保存数年，加入氯仿可防止污染
RNA的保存
-70C·DEPC水或无Rnase水中，较长期保存，RNA沉淀，可在-20”C下长期保存于70%乙醇或去离子甲酷胺溶液中
DNA分离纯化技术
细胞的破碎
化学法:表面活性剂·SDS、Tween80 等 酶解法:蛋白酶K、溶菌酶、纤维素酶等 物理法:高速组织捣碎机玻璃匀浆器研磨液氨研磨超声波破碎冻融法
蛋白质等杂质的去除
酚·氯仿抽提法:裂解液加入样本溶液，破坏氢键，核蛋白解聚:抑制DNA酶的活性，降低细胞膜的稳定性;核酸从蛋白质上游离出来;将蛋白质笑话成小的片段·促进核酸蛋白质分离。离心后取上清液，加入Tris饱和酚、氧仿溶液·取上清液后加入乙醇·离心后沉淀为DNA
沉淀或吸附核酸
亿醇( 对盐类沉淀少:沉淀中所含痕量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。》，异丙醇( 需体积小，速度快，适于浓度低，体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。
RNA分离纯化技术
总RNA
异硫氰酸脑-酚氮仿一步法-TRIzol法
单相裂解试剂法
RNA提取试剂盒
mRNA
寡聚(dT)一纤维素柱层析法
赛聚(dT )一纤维素液相离心法-用寡聚( dT)纤维素直接加入到总的RNA溶液中共使mRNA与宴聚(dT)一纤维委结合，离心收集宴聚(dT)一纤维素/mRNA复合物，再用洗脱液分高mRNA·然后离心除去寡聚(dT )一纤维素
样本的获得和处理
三、纯化
(目的）如何保持核酸纯度:去除其他生物大分子如蛋白质·多糖和脂类分子;去除有机溶剂和过高浓度的金属离子:排除其他核酸分子的污染。用DNA分离纯化技术使基因组DNA的沉淀
基因组DNA进一步纯化
凝胶电泳:配胶·制胶板~上样、电泳、检测
吸附柱法提DNA- 使用特殊的硅基质滤膜，在低PH值 高浓度盐存在条件下，可选择性吸附DNA片段，蛋白质和其它杂质不会被吸附。通过一系列漂洗、高心等步骤将残留的引物·核普酸《蛋白质等杂质去除。最后用低盐高PH值的洗脱缓冲液将纯净的DNA从滤膜上洗脱下来。
磁珠法:在磁珠表面修饰有对DNA有吸附作用的官能基团通过其与DNA的可逆结合、磁场对磁珠的作用来分离纯化DNA
质粒DNA的分离纯化
碱裂解法
煮沸裂解法
SDS裂解
吸附桂法
四、检测
漠乙键荧光法
原理:荧光染料漠化乙锭(EB )嵌入核酸碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出橙红色荧光·荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准曲线·可比较出被测DNA溶液浓度。 纯度鉴定:EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核酸制品的纯度。可以鉴定DNA制品中有无RNA的干扰，亦可鉴定在RNA制品中有无DNA的污 染。
紫外分光光度法
原理:DNA或RNA链上碱基的苯环结构(共扼双键)在紫光区最大吸收峰在260nm处。DNA或RNA的光密度OD260不仅与总合量有关，也随构型而有差异 纯度鉴定:核酸在260nm处有最大吸收峰;蛋白质在280nm处有最大吸收峰:盐和小分子在230nm处有最大吸收峰
