细菌检验基本技术

这是一篇关于细菌检验基本技术的思维导图，细菌形态学检查方法模块，包含不染色标本检查（悬滴法、压滴法）与染色标本检查（革兰染色、抗酸染色等），清晰梳理细菌形态观察的基础方法与适用场景；细菌的培养与分离技术模块，从培养基（主要成分、分类、制备）、细菌的人工培养（接种方法、培养方式、生长现象、培养基选择）两大维度，搭建细菌培养与分离的核心知识体系；细菌的生化鉴定技术模块，涵盖碳水化合物代谢试验、蛋白质和氨基酸代谢试验、碳源利用试验、呼吸酶类试验、其他生化鉴定试验、复合生化试验六大分支，详细列举了氧化发酵试验、触酶试验、氧化酶试验、吲哚试验、CAMP 试验、O/F 试验等高频考点与实操项目；细菌非培养检验技术模块，整合免疫学检验（抗原 / 抗体检测）、分子生物学检验（PCR、基因芯片）、细菌毒素检验、特殊染色检验、动物实验等现代检验技术，覆盖非培养状态下的细菌鉴定方法；细菌检验的自动化模块，梳理微生物标本前处理系统、自动化细菌培养系统、微生物自动分析系统等自动化设备应用，适配临床实验室自动化检验场景。这款细菌检验基本技术思维导图模板，专为医学检验专业学生、医学考研 / 检验职称考试备考者、医院微生物检验科从业者、医学教育工作者设计，也可作为医学微生物检验教学课件、备考笔记、实操参考的核心工具，逻辑清晰、层级分明，可直接套用修改，快速搭建细菌检验知识体系，告别知识点零散、体系混乱、考点易混淆的学习痛点。

细菌检验基本技术

• 细菌形态学检查方法
  • 一、显微镜
    • 1.普通光学显微镜
      • 油镜可放大1000倍
    • 2.暗视野显微镜
      • 照明光线不直接进入物镜，只允许标本反射和衍射的光线进入物镜→背景暗，菌体亮。
      • 常用于不染色标本的动力及运动状况检查。
    • 3.荧光显微镜
      • 用于观察细菌结构及鉴别细菌
    • 4.相差显微镜
      • 标本不同部位密度不同→光位相差异→光强度差异→显示细菌不同部位差异
      • 不染色活细菌的形态、内部结构及运动方式的观察。
    • 5.电子显微镜
      • 透射电子显微镜（TEM）：观察细菌、病毒的超微结构。
      • 扫描电子显微镜（SEM）：表面结构，三维立体图像。
  • 二、不染色标本的检查
    • 一般用于观察细菌的运动及运动情况
      • 有动力：有明显位移
      • 无动力：原地颤动，不规则的布朗运动
    • 常用方法
      • 压滴法
      • 悬滴法
  • 三、染色标本的检查
    • （一）常用染料
      • 1.碱性染料（细菌学检查常用）
        • 常用：碱性亚甲蓝、结晶紫、碱性复红等
        • 带正电荷，易与带负电荷的被染物结合； 细菌PI：2-5，在碱性、中性、弱酸性染料中带负电荷。
      • 2.酸性染料
        • 常用：伊红、酸性复红、刚果红等
      • 3.中性染料
        • 常用：伊红亚甲蓝、伊红天青等
    • （二）常用细菌染色方法
      • 1.革兰染色
        • 原理
          • ①细胞壁学说：G+菌细胞壁致密、肽聚糖层厚、脂质含量少、乙醇不易透入；G-反之
          • ②等电点学说：G+菌PI较G-菌低，相同PH下，带更多的负电荷，与带正电荷的结晶紫结合更牢固。
          • ③化学学说：G+菌中核糖核酸镁盐多，与结晶紫和碘结合牢固，不易脱色。
      • 2.抗酸染色
        • 细菌着色后不被盐酸乙醇脱色，代表方法：萋-尼染色法。
        • 针对性用于结核病、麻风病的细菌检查（若改变脱色剂，诺卡菌亦可呈弱酸性）。
      • 3.荧光染色
      • 4.负染色
        • 使标本背景着色而细菌不着色的染色方法。
        • 常用染料：墨汁、酸性染料（酸性染料带负电荷，故菌体不着色，只使背景着色）
      • 5.特殊染色
        • 细胞壁染色、荚膜染色、芽孢染色、鞭毛染色、异染颗粒染色等。
• 细菌的培养与分离技术
  • 菌落：由一个细菌繁殖而来的肉眼可见的细菌集落。
  • 一、培养基
    • 人工方法配置而成，适合于微生物繁殖需要的混合营养基质。
    • （一）主要成分及作用
      • 1.营养物质
        • 提供细菌生长繁殖所需要的能量、合成菌体的原料以及激活细菌酶的活性和调节渗透压等作用。
        • （1）蛋白胨
          • 供给细菌氮源，缓冲作用
        • （2）肉浸液
          • 氮源和碳源
        • （3）牛肉膏
          • 无糖，可做肠道细菌鉴别培养的基础成分
        • （4）糖（醇）类
          • 碳源、鉴别细菌（细菌对糖利用能力的差异）
        • （5）血液
          • 应用于营养要求高的细菌，还能观察溶血现象
        • （6）鸡蛋与动物血清
          • 营养要求高的细菌， 如结合分枝杆菌的鸡蛋培养基和白喉棒状杆菌的吕氏血清斜面培养基
        • （7）无机盐
        • （8）生长因子
          • 流感嗜血杆菌需要Ⅹ因子和Ⅴ因子
      • 2.水
      • 3.凝固物质
        • （1）琼脂
          • 最常用，最合适的凝固物质
          • 100℃溶解，45℃以下凝固
        • （2）明胶
          • 24℃以上溶解，20℃以下凝固
          • 主要成分是蛋白质，可用于鉴别培养基，观察细菌对明胶有无液化作用
      • 4.抑制剂
        • 抑制或减少非检出菌生长，有利于检出菌生长的物质
      • 5.指示剂
        • 目的：观察和鉴别细菌是否利用糖类、氨基酸等物质
        • 酸碱指示剂
          • 常用：酚红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中性红、甲基红等
        • 氧化还原指示剂
          • 常用：亚甲蓝和刃天青
    • （二）分类
      • 1.按用途分
        • （1）基础培养基
          • 肉浸液、普通琼脂平板等
        • （2）营养培养基
          • 在基础培养基中加入血液、血清及生长因子等，供营养要求高和需要特殊生长因子的细菌生长
          • 血琼脂平板（BAP）、巧克力色平板
        • （3）选择培养基
          • SS琼脂平板：胆盐抑制G+菌、枸橼酸钠和煌绿抑制大肠埃希菌
            • 有利于沙门菌和志贺菌的分离
        • （4）鉴别培养基
          • 通过指示剂鉴别
            • 糖发酵管、克氏双糖铁琼脂（KIA）
          • 选择和鉴别功能结合
            • SS琼脂平板
            • 伊红亚甲蓝琼脂平板（EMB）
            • 麦康凯琼脂平板（MAC）
        • （5）特殊培养基
          • 厌氧培养基、细菌L型培养基（高渗低琼脂）等
      • 2.按物理性状分
        • （1）液体
          • 常用于增菌培养，也可用于接种纯种细菌观察生长现象
        • （2）半固体
          • 观察细菌的动力，保存菌种
        • （3）固体
          • 制成平板——微生物分离纯化、鉴定及药敏试验等 制成斜面或高层——鉴定和菌种的短期保存
    • （三）制备
      • 1.调配
      • 2.溶解
      • 3.校正PH
      • 4.分装
      • 5.灭菌
        • 高压蒸汽灭菌法
        • 间歇蒸汽灭菌法
        • 滤过除菌法
        • 血清凝固器灭菌法
      • 6.质量检验
        • ①无菌试验——判定灭菌是否合格
        • ②效果检验——判断培养基是否符合要求
      • 7.保存
  • 二、细菌的人工培养
    • （一）无菌技术
    • （二）细菌的接种与分离方法
      • 1.平板划线法
        • 使标本中混杂的多种不同细菌分散生长，形成单个菌落
      • 2.琼脂斜面接种法
        • 用于纯种增菌及保存菌种
      • 3.液体接种法
        • 液体培养基的接种
      • 4.穿刺接种法
        • 保存菌种或观察细菌的动力和生化反应
      • 5.涂布接种法
        • 常用于纸片药敏试验，也可用于细菌计数
      • 6.倾注平板法
        • 兼性厌氧菌或厌氧菌的稀释定量培养，饮水、尿液等标本活菌计数
    • （三）细菌的培养方式
      • 1.需氧培养法
      • 2.二氧化碳培养法
        • 5%—10%的CO2
        • 二氧化碳培养箱
        • 烛缸法
      • 3.微需氧培养法
        • 5%O2，10%CO2, 85%N2
        • 微需氧菌，如空肠弯曲菌、幽门螺杆菌
      • 4.厌氧培养法
    • （四）细菌的生长现象
      • 1.在固体培养基中
        • 细菌菌落描述
          • 大小、形状(露滴形、圆形、菜花形、不规则形等）、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、波形、锯齿形及卷发状等）、透明度、颜色、表面(光滑、粗糙)、黏度等
          • 根据表面特征分三型
            • ①光滑型菌落（S型）
            • ②粗糙型菌落（R型）
            • ③黏液型菌落（M型）
              • 肺炎克雷伯菌
        • 用于鉴定细菌的菌落特征
          • 溶血现象、色素、特殊气味等
      • 2.在液体培养基中
        • ①混浊生长：大多数细菌
        • ②沉淀生长：少数链状排列的细菌，如链球菌、炭疽芽孢杆菌
        • ③表面生长：形成菌膜
      • 3.在半固体培养基中
        • 有鞭毛——除沿穿刺线生长外，其两侧也可见羽毛状或云雾状浑浊生长→动力实验阳性
        • 无鞭毛——只能沿穿刺线呈线状生长→动力试验阴性
    • （五）培养基的选择
      • 痰标本：血琼脂、巧克力、中国蓝 尿液：血琼脂、中国蓝 粪便：SS、中国蓝 脑脊液：血琼脂、中国蓝、巧克力 脓液：血琼脂、中国蓝 生殖道：血琼脂、中国蓝、巧克力、淋球菌 厌氧：厌氧平板、厌氧产气袋 霍乱弧菌：碱性琼脂，TCBS琼脂
• 细菌的生化鉴定技术
  • 一、碳水化合物代谢试验
    • 1.糖（醇、苷）类发酵实验
      • 【原理】：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力不同，分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。
      • 【结果】： 产酸：培养基中的指示剂呈酸性反应 产气：可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。 不分解：培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化
      • 【应用】：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。 大肠埃希菌可发酵葡萄糖和乳糖； 沙门菌属只能发酵葡萄糖，不发酵乳糖； 大肠和志贺菌均能发酵葡萄糖，但产物不同。
    • 2.氧化-发酵实验（O-F试验）
      • 【原理】： 氧化型：仅在有氧环境中分解葡萄糖。 发酵型：在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖。 产碱型：在有氧或无氧环境中都不能分解葡萄糖。
      • 【应用】： 肠杆菌科细菌（发酵型） 非发酵菌（产碱型/氧化型） 葡萄球菌（发酵型） 微球菌（氧化型）
    • 3.β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
      • 【原理】：
      • 【结果】：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30min内显色。
      • 【应用】：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。 本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定
    • 4.七叶苷水解试验
      • 【原理】：
      • 【应用】：主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别；D群链球菌（+）；其它链球菌（-） 也可用于G-菌的鉴定：克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属可水解七叶苷。
    • 5.甲基红（MR)试验
      • 【原理】：
      • 【应用】：大肠埃希菌（+）；产气肠杆菌（-）
    • 6.V-P试验
      • 【原理】：
      • 【应用】：本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。
  • 二、蛋白质和氨基酸代谢试验
    • 1.吲哚试验
      • 细菌中的色氨酸酶→分解色氨酸→生成吲哚→红色玫瑰吲哚
      • 肠杆菌科的鉴定
    • 2.硫化氢试验
      • 细菌分解含硫氨基酸→硫化氢→与铅或亚铁离子生成黑色硫化物
      • 肠杆菌科的鉴定
    • 3.尿素酶试验
      • 细菌产生尿素酶分解尿素产生大量氨→培养基呈碱性→酚红指示剂变红
      • 变形杆菌属、摩根菌属和普罗威登菌属的鉴定
    • 4.苯丙氨酸脱氨酶试验
      • 苯丙氨酸脱氨酶→苯丙氨酸脱去氨基→苯丙酮酸（与三氯化铁结合→游离化合物）+游离氨
      • 肠杆菌科鉴定 变形杆菌、摩根菌属、普罗威登菌属细菌均阳性，其他阴性
    • 5.氨基酸脱羧酶试验
      • 赖氨酸
      • 鸟氨酸
      • 精氨酸
      • 脱羧
        • 尸胺
        • 腐胺
        • 精胺
  • 三、碳源利用试验
    • 1.枸橼酸盐利用试验
      • 利用铵盐作为唯一氮源 并能以枸橼酸盐作为唯一碳源
        • 可在枸橼酸盐培养基上分解枸橼酸钠→生成碳酸钠→培养基变碱性
    • 2.丙二酸盐利用试验
      • 细菌利用丙二酸盐作为唯一碳源→分解丙二酸钠生成碳酸钠→培养基变碱
    • 3.醋酸盐利用试验
      • 利用铵盐作为唯一氮源 利用醋酸盐作为唯一碳源
        • 可在醋酸盐培养基中生长→生成碳酸铵，培养基变碱性
      • 肠杆菌科中埃希菌属为阳性，志贺菌属为阴性 铜绿、荧光、洋葱假单胞菌也为阳性
    • 4.马尿酸盐水解实验
      • 马尿酸在马尿酸水解酶的作用下水解为苯甲酸（与三氯化铁结合→苯甲酸铁沉淀）和甘氨酸
      • 链球菌的鉴定：B群链球菌分解马尿酸钠——阳性 其余链球菌阴性
    • 5.乙酰胺利用试验
      • 乙酰胺在脱酰胺酶的作用下释放氨基使培养基变碱
      • 非发酵菌的鉴定
        • 铜绿、去消化产碱杆菌、食酸假单胞菌为阳性
        • 其他发酵菌大都为阴性
  • 四、呼吸酶类试验
    • 1.氧化酶试验
      • 肠杆菌科——阴性
      • 弧菌科、非发酵菌——阳性，奈瑟菌属、莫拉菌属也阳性
    • 2.过氧化氢酶（触酶）试验
      • G+菌的初步鉴定
        • 葡萄球菌，微球菌（+）
        • 链球菌（-）
    • 3.硝酸盐还原实验
      • 肠杆菌科细菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐
      • 铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等科产生氮气
  • 五、其他生化或鉴定细菌常用试验
    • 1.凝固酶试验
      • 鉴定葡萄球菌致病性的重要指标
      • 结合凝固酶（结合在细胞壁上的)——玻片法检测
      • 游离凝固酶（分泌至菌体外的）——试管法检测
    • 2.卵磷脂酶试验
      • Ca2+存在情况下，细菌产生的卵磷脂酶（α-毒素）→迅速分解卵磷脂，菌落周围形成乳白色混浊环
      • 厌氧菌的鉴定
        • 蜡样芽孢杆菌、产气荚膜酸菌、诺维梭菌（+）
        • 其他梭菌（-）
    • 3.DNA酶试验
      • 金葡
      • 肠杆菌科中沙雷菌和变形杆菌
      • （+）
    • 4.胆汁溶菌试验
      • 肺炎链球菌（+）
      • α链球菌（-）
    • 5.CAMP试验
      • B群链球菌（无乳链球菌）产生CAMP因子，能促进葡萄球菌的β-溶素的溶血活性
      • 在两菌生长交界线处溶血能力增加→箭头形透明溶血区
    • 6.氢氧化钾拉丝试验
      • 革兰阴性菌的细胞壁在稀碱溶液中破裂，释放出来未断裂的DNA→菌悬液呈黏性，接种环搅拌后拉出粘丝。
    • 7.杆菌肽实验
      • A群链球菌对杆菌肽几乎100%敏感，而其他链球菌耐药
    • 8.奥普托欣（Optochin）试验
      • 肺炎链球菌（+）
    • 9.O/129抑菌试验
      • 弧菌属、邻单胞菌属、发光杆菌属敏感
      • 气单胞菌、假单胞菌耐药
  • 六、复合生化试验
    • 1.克氏双糖铁（KIA）或三糖铁琼脂培养基试验
      • 【原理】：培养基含有葡萄糖和乳糖（蔗糖），其中乳糖（蔗糖）含量多。 能发酵乳糖和葡萄糖的细菌产酸量大，使KIA斜面和底层均呈黄色； 只能发酵葡萄糖的产酸少，斜面部分酸挥发，只有底层呈黄色。 能分解含硫氨基酸的，产生的H2S在酸性条件下形成黑色沉淀物硫化铅或硫化亚铁。
      • 【应用】：主要应用于肠杆菌科细菌的初步鉴定。
    • 2.动力-靛基质-尿素酶（MIU）试验
      • 【原理】：MIU培养基是以酚红为指示剂的含色氨酸和尿素的半固体培养基。 细菌产色氨酸酶→降解色氨酸→形成吲哚→加吲哚试剂→培养基上层变红色； 细菌产尿素酶→降解尿素→产氨→培养基变碱呈红色 有动力的细菌除沿穿刺线生长外，在穿刺线两侧也可见羽毛状或云雾状浑浊生长。
      • 【应用】：常用于肠杆菌科细菌的鉴定。
• 细菌非培养检验技术
  • 一、免疫学检验
    • （一）抗原检测
      • 凝集试验
      • 免疫荧光技术（IFA）
      • 酶联免疫吸附试验（ELISAL
    • （二）抗体检测
  • 二、分子生物学检验
    • 核酸杂交技术
    • 聚合酶链反应（PCR）
    • 生物芯片技术
      • 基因芯片
      • 蛋白质芯片
  • 三、细菌毒素检验
    • （一）内毒素检验
      • 鲎实验
        • 内毒素：G-菌细胞壁的脂多糖。鲎试剂：鲎血液中的有核变形细胞，内含凝固酶原。
        • 原理：内毒素与鲎试剂接触→激活凝固酶原→可溶性的凝固酶原变成凝胶状态的凝固蛋白
    • （二）外毒素检验
      • 体内毒力试验
      • 体外毒力试验
  • 四、降钙素原检验
    • 严重细菌感染时，PCT水平大量升高，感染控制后PCT水平下降。
    • 病毒感染PCT不升高→鉴别细菌性与病毒性感染。
  • 五、动物实验
• 细菌检验的自动化
  • 微生物标本前处理系统
  • 自动血液培养系统
  • 自动化细菌鉴定药敏系统
  • 微生物医院内感染分析系统
  • 微生物实验室信息化
  • 微生物自动化检测系统