导图社区细胞培养与实践

细胞培养与实践

细胞培养与实践的思维导图，介绍了细胞培养的基础、细胞培养在药理学和药物开发中的应用、细胞培养在免疫学领域的应用、干细胞培养技术及其在再生医学中的应用、细胞培养技术在药理学中的应用。

编辑于2023-10-26 20:57:48

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细胞培养与实践

细胞培养的基础

1.细胞培养的基本条件

细胞培养实验室

设施

设备

2.细胞培养的基本技术

（1）无菌技术

①操作范围的消毒

擦拭

紫外照射

②洗手和着装

③培养用品的清洗和消毒灭菌

清洗

包装

消毒灭菌

④无菌培养操作

（2）培养材料的选择和处理

①胚胎和成体组织来源

②正常和肿瘤组织来源

③取材方法

（3）细胞培养类型及技术

①原代培养

组织块培养法

单细胞的制备及培养

②传代培养

组织块的传代

贴壁细胞的传代培养

悬浮细胞的传代培养

（4）细胞形态学检查

①倒置显微镜观察细胞形态和结构

a.普通染色法观察—吉姆萨（Giemsa）染色法、苏木精-伊红染色法（HE染色）

b.特殊染色法观察—特殊染色法观察、细胞脂类染色、 DNA/RNA染色

②相差显微镜观察活细胞的生活特性

细胞内各种结构间呈现清晰可见的明暗对比

③利用荧光显微镜观察细胞的形态和结构

a.DNA/RNA吖啶橙荧光染色法

b.免疫荧光染色法

④利用荧光显微镜观察细胞的形态和结构

a.透射电镜（TEM）

b.扫描电镜（SEM）—形成三维结构图像

（5）培养细胞污染的检测和排除

①微生物的污染与检测

a.真菌污染及检测—烟曲霉菌、黑曲霉菌、白假丝酵母菌等

b.细菌污染及检测—大肠杆菌、假单胞菌、葡萄球菌等

c.支原体污染及检测— 细胞污染中最常见

②细胞污染的预防和排除

a.细胞污染的预防措施—建立细胞库、针对污染来源、针对操作

b.微生物污染的排除—抗生素排除法、加温除菌、动物体内接种

c.避免细胞交叉污染

（6）细胞的冻存、复苏和运输

细胞冻存和复苏的基本原则:慢冻快融

3.培养细胞研究及检测技术

（1）细胞周期分析法

①细胞周期—S期细胞最易受损

②培养细胞的生长过程

③细胞的生命期

a.体内组织细胞

b.离体培养细胞生命期—短暂传代、有限传代、获得不死性

④细胞周期分析

a.流式细胞术：G0期、G1期、S期、G2/M期

b.Annexin V/PI双染法:检测细胞凋亡、细胞膜完整性

（2）细胞融合

①自然融合

②人工诱导融合

③同核细胞融合

④异核细胞融合

（3）细胞克隆技术

克隆培养的关键是细胞的分离

提高克隆形成率的措施

增强细胞同化能力：如胎牛血清、细胞因子

增强细胞的帖壁能力：如软琼脂、制备底层饲养层细胞

（4）细胞培养在病毒增殖和疫苗生产中的应用

病毒蚀斑；细胞病变效应

（5）培养细胞的转化

无限细胞系/连续细胞系

（6）细胞凋亡(程序性细胞死亡)

①形态学检测

②生物化学检测

a.琼脂糖凝胶电泳检测

b.末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记检测（TUNEL）

c.Annexin V / PI检测细胞凋亡

d.检测亚二倍体DNA峰判定凋亡

（7）培养细胞基因倒入技术

①基因转导技术

②基因转导技术

a.染色体转导

b.基因转染

③转基因技术

（8）细胞酶活性测定

细胞化学技术

a.酸性磷酸酶

b.葡萄糖-6-磷酸酶

c.葡萄糖-6-磷酸酶

细胞培养在药理学和药物开发中的应用

1.药物对培养细胞增殖的影响

（1）MTT法

（2）有丝分裂指数法

2.细胞对药物摄取的实验

3.细胞对药物转运的实验

细胞培养在免疫学领域的应用

1. 免疫细胞的制备、分离及纯化

免疫细胞分离原理

①基于细胞物理性状

②基于细胞表面标记

（1）外周血单个核细胞悬液的制备

（2）淋巴细胞的分离和纯化

①玻璃器皿吸附法

②磁铁吸附法

③羟基铁-乳胶分层液法

④吸附柱过滤法

（3）T细胞和B细胞的分离

①免疫磁珠法分离T细胞和B细胞

②用尼龙毛柱分离T细胞和B细胞

③流式细胞仪分离T细胞和B细胞

（4）T细胞亚群的分离

①抗体/补体介导的特异性细胞毒作用分离T细胞亚群（T subset）

②盘选（panning）分离法分离T细胞亚群

（5）单核巨噬细胞的分离

（6）单核巨噬细胞的分离

2.免疫活性细胞数量的检测

（1）微量细胞毒试验检测各类免疫细胞的数量

（2）免疫荧光染色技术检测各类免疫细胞数量

（3）流式细胞术检测各类免疫细胞数量

（4）免疫酶染色技术检测各类免疫细胞的数量

3.淋巴细胞增殖活性检测

（1）淋巴细胞增殖试验原理

（2）淋巴细胞增殖的形态学检查

（3）MTT检测法淋巴细胞增殖的形态学检查

4.免疫细胞的细胞毒活性检测

（1）形态学检查法---淋巴细胞对肿瘤细胞的细胞毒试验

干细胞培养技术及其在再生医学中的应用

1.干细胞基础知识

（1）干细胞的特性

（2）干细胞分类

（3）干细胞的研究历史

（4）干细胞的来源

（5）干细胞的分化潜能

（6）胚胎及成体干细胞的差异

2.胚胎来源的多能性干细胞

（1）ES、EG、EC cells

（2）ES cells 的分离和培养

（3）ES cells 的自我更新和分化能力

3.诱导性多能干细胞

（1）逆转细胞命运的方法：去分化、重编程

①核移植

②核融合

（2）“多能性”转录因子

（3）“多能性”转录因子

（4）iPS细胞研究的意义及问题

4.干细胞在再生医学中的应用

（1）再生医学的概念

（2）造血干细胞移植

①分类

②主要适应症

③移植过程

④治疗步骤和策略

⑤存在的问题和研究热点

⑥临床应用的推广

（3）自体角膜缘干细胞移植

（4）神经干细胞的应用

（5）皮肤干细胞与美容

①皮肤的基本结构

②自体细胞除皱的两大优势

a.有效性

b.安全性

（6）其他应用

①心肌修复

②ES细胞疗法治疗糖尿病

③间充质干细胞

（7）相关法律法规

细胞培养技术在药理学中的应用

1.实验细胞

（1）细胞优缺

（2）如何选择

原代细胞不细胞系/株的比较

（3）研究热点

细胞生长于细胞分化

细胞增殖与细胞周期的调控

细胞的衰老与死亡

细胞表面受体与信号转导

囊泡转运

线粒体

细胞骨架

离子通道

基因组

2.在肿瘤研究中的应用

（1）影响肿瘤细胞生长实验（药物敏感试验）

（2）肿瘤细胞迁移试验

（3）肿瘤细胞侵袭试验

（4）肿瘤分化诱导模型的建立

①白血病细胞分化诱导实验

②实体瘤分化诱导模型

（5）肿瘤细胞端粒酶活性的检测

（6）肿瘤细胞基因及其表达产物检测

①) 癌基因及抑癌基因检测

②癌基因及抑癌基因检测方法

a.放射免疫分析方法

b.化学发光免疫分析

c.电化学发学免疫分析??

d.免疫细胞化学技术

e.流式细胞术

f.PCR技术

g.基因诊断技术

（7）裸鼠人体肿瘤秱植瘤模型制备及试验

3.在其它药理学及药学研发中的应用

（1）细胞对药物转运的实验（肠吸收）

（2）构建人血脑屏障药物筛选模型

（3）微核试验——毒理学应用

细胞计数法

台盼蓝排斥法

细胞活性和增殖的检测

培养细胞的常规观察

形态、生长、培养液颜色（pH）、污染与否

培养细胞的活力检测

台盼蓝、MTT、CCK8、克隆形成实验

细胞的传代与维持

换液、传代，冻存、复苏。

传代方法

A消化法——贴壁细胞

B直接吹打法——部分贴壁不牢的细胞

C离心或自然沉降法——悬浮细胞