细胞实验基本操作

细胞实验基本操作，包括传代/计数/冻存/铺板/MTT法测细胞活力的基本操作，有助于细胞学实验生手迅速上手。师兄亲授经验，可供参考，但不是唯一标准。

细胞实验基本操作

• 细胞传代
  • 1.倒掉培养基。需要先轻微摇晃震荡，有一些漂浮的死细胞
  • 2.加1ml胰酶。中和，因为培养基中含FBS为碱性，而胰酶为酸性。轻轻震荡后弃掉。注意侧面和底面都要震荡到。
  • 3.加1ml胰酶，37℃消化2min。通过敲击培养瓶底观察细胞脱落情况或通过显微镜观察
  • 4.消化程度达到后，再加入1ml培养基，中止消化。用移液管从上往下吹打细胞，将细胞都吹下来，并数次吹打。
  • 5.将培养瓶中的细胞悬液转移到离心管中，1500r离心5min，弃去上清
  • 6.在离心管中加入1ml培养基，再进行数次吹打，使细胞分散。按数量大概吹打20次左右。
  • 7.将离心管中的细胞悬液按照1传2或1传3的比例分别传至新的培养瓶中
• 细胞冻存
  • 用于冻存的细胞密度一般大于传代细胞
  • 细胞离心时可以配制冻存液：90%的完全培养基+10%的DMSO （不同细胞要求不同） 一般一个冻存管需要1-1.5ml的冻存液。配制时先少1ml培养基（用于吹打离心管中的细胞）以外的液体。
  • 弃去上清的离心管中加入1ml培养基吹打细胞，再加入其余的冻存液（不完全），吹打混匀后分装到冻存管中。白胶带封口。做标记：细胞，人员，日期。
  • 4℃存放30min或-20℃下存放20min后（不能超过该时间），再转移到-80℃保存。
• 细胞计数
  • 用于铺板前一般要先计数。计数用血细胞计数板
  • 一般用离心后再吹打的细胞悬液进行计数。需要进行稀释再加样
  • 先盖好盖玻片，轻微翘起一侧，在外边缘的加样处上样。一般加10微升。细胞悬液浸润后放在显微镜下计数
  • 一般计数四个角上的大格子中的细胞总数（一个大格子的体积是0.1微升）。 计上不计下，计左不计右
  • 原细胞悬液中的细胞密度：=（总数/4）*10000*稀释倍数（个/ml）
• MTT法
  • MTT试剂一般避光保存在冰箱中4或-20℃（锡纸包裹）；操作时关掉超净台的照明。 母液一般为5mg，需要稀释十倍。
  • 96孔板每孔加100微升。按总体积和浓度进行稀释，配好后需要震荡混匀。加试剂与加药的操作类似，先吸去原本的培养基，再加入MTT试剂。可以分排加也可以一起，加了MTT细胞就死了。
  • 37℃孵育3.5h。一般可以在底部看到蓝色的结晶。
  • 加DMSO。将96孔板拿到外面实验室（可以不在超净台上操作）除去孔内的试剂，将96孔板去盖后完全翻转，下面垫一张吸水纸，先倒掉一部分，但是不能大力敲击。再用移液枪将残余的液体吸干净，一定要吸干，且不能碰到底部。沿壁加每孔100微升DMSO
  • 摇10min（有摇床或其他机器），在酶标仪490nm条件下测试吸光度。
• 96孔板给药
  • 铺板后在37℃培养24h后给药。
  • 先配药，用不含血清的培养基作为溶剂（只在给药的时候用不含血清的培养基）。算好总数和浓度。（一般药物的体积可以忽略，直接加一个按培养基总体积计算就行） 可以先取好所需的ep管，盖上做好标记之后，在其中配药。还是按每孔100*或200微升给药。
  • 先加培养基，再向其中加入药物母液，一般直接打到液面以下吹吸几次混匀。全部配好药后再上下震荡。药物母液用DMSO配制，在配母液时就要计算好在给药时DMSO的浓度小于5‰，DMSO的毒性较大且溶解性低。
  • 加药时先除去原本的培养基（可以先把一排大部分的培养基吸去后再一起吸去剩余的残量），可以一排一排或两排一起。尽量不要让细胞再失去培养基的环境中待太久。要沿壁吸取培养基，不能戳到底部的细胞。
  • 再按给药顺序加配好的药。同一组药浓度从低到高可以不换枪头。
  • 一般药物处理24h
• 铺板
  • 计数后再铺板，一般在96孔板中每孔20000个细胞。这样可以在给药和测试时（70%到80%）达到适宜的细胞密度
  • 12*8的孔只用到中间10*6，边上一圈不用，可能会有边缘效应。但是需要用PBS（磷酸缓冲盐溶液）或不含血清的培养基加上，避免风干。
  • 铺板前，先配好适宜浓度的细胞悬液。按每孔加100或200微升来计算，达到每孔20000个细胞。如加100微升每孔，需要的细胞密度为200000个/ml，然后计算所需的总体积（略多于60个孔*100微升，避免不够）。用含血清的培养基稀释。 六孔板一般给药2ml，所需的细胞密度为400000个/ml。
  • 一般将细胞悬液配制在96孔板的包装盒中，在拆包装时就注意保持洁净。 一般将一头垫高，轻轻摇晃，使细胞均匀。时不时需要摇晃，因为细胞容易沉底。
  • 铺板时要注意沿孔壁加，轻轻往下打，避免产生气泡。铺板结束后不能摇动。 可以在96孔板外贴白色胶带，避免出现盖和板的意外分离。作标记，细胞，人员和时间
• 基本操作注意事项
  • 移液枪使用要选靠近最大量程的，越靠近小量程越不准
  • 调量程时可以先调过一点再调回来会更准
  • 胰酶可以保存在4或-20℃中，长期保存最好在-20℃
  • 不能用手碰到96孔板底部，会影响吸光度的测定