生物样品预处理

生物分离与纯化技术 第二章 预处理及固液分离，主要包含发酵液预处理和细胞破碎两部分内容，介绍了发酵液预处理的方式和作用，以及细胞破碎的方式、原理、特点等等。

生物样品预处理

• 改变发酵液的滤过特性
  • 降低发酵液黏度
    • 加水稀释法：增加液体体积，增大后续处理任务
    • 加热法：适用于耐热的目的产物提取
  • 调节PH
    • 调节PH，可以使部分杂质发生凝聚现象，然后固液分离
  • 凝聚与絮凝
    • 作用：增大发酵液中悬浮粒子体积，加速颗粒沉降。
    • 凝聚：电解质作用下破坏细胞、菌体、蛋白质等胶体粒子的表面电荷，使其聚集
    • 絮凝：使用高分子絮凝剂将胶体粒子交联成网形成较絮凝团（10mm)
  • 加入助滤剂
    • 助滤剂：不可压缩的多孔微粒，使滤饼疏松，吸附胶体，扩大过滤面积，滤速增大。常用硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩等
  • 加入反应剂
    • 在发酵液重加入可以与杂质发生反应的，但不影响产物的反应剂，消除某些物质，便于提高滤速
• 去除发酵液中的杂质
  • 高价金属离子去除
    • Ca2+：加入草酸，一方面形成草酸钙沉淀，一方面可以酸化发酵液，调节ph
    • Mg2+：可用草酸，但效果不好，一般用三聚磷酸钠，会与镁离子形成络合物，从而出去镁离子
    • Fe2+：加入黄血盐，形成普鲁士蓝沉淀除去铁离子
  • 杂蛋白去除
    • 等电点沉淀法
    • 变形沉淀法：大幅改变PH值、加乙醇、丙酮等有机溶剂，；加重金属盐、表面活性剂等；加热变性。一般不适用于蛋白质产物
    • 吸附法：用吸附剂或者沉淀剂吸附杂蛋白
  • 不溶性多糖去除
    • 不溶性多糖会使发酵液黏度增大。一般采用酶解法降解多糖
  • 有色物质去除
    • 一般采用活性炭、离子交换树脂等吸附剂脱色
• 细胞破碎
  • 机械法
    • 高压匀浆法：大规模破碎细胞。
      • 适用于酵母和大多数细胞
      • 团状和丝状真菌不宜使用，容易造成堵塞
      • 影响因素：温度、压力、菌液经过匀浆伐的次数。
    • 高速珠磨法
      • 研磨机内加入细胞悬浮液、玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂，快速搅拌破碎细胞，释放内含物，然后在珠液分离器的作用下分离珠子和浆液。
      • 影响因素：进料速度。珠粒大小和数量、细胞悬液浓度、温度
    • 超声波破碎法
      • 超声波破碎仪，15~20khz的高频振动，细胞剧烈震荡破碎。原理：空穴现象
      • 影响因素：频率、温度、压强、破碎时间、介质的离子强度等
  • 非机械法
    • 渗透压冲击法：低渗溶液吸水涨破。适用于细胞壁脆弱或者预先处理过细胞壁的细胞
    • 冷冻融化法
      • 低温（－15℃）冷冻，室温融化，反复多次，细胞壁破裂。
      • 原理：细胞膜疏水键被破坏，变得亲水；同时细胞内形成冰晶，引起细胞膨胀或者破裂
    • 化学法
      • 酸碱处理法
        • 酸碱会和细胞壁发生多重反应，酸处理常用6mol/L HCl ,碱处理不常用，容易使蛋白质变性
      • 表面活性剂
        • 引起细胞溶解同时是细胞内某些组分渗透出来，常用十二烷基磺酸钠（SDS)
        • 原理：表面活性剂一端亲水，一端疏水，溶解细胞膜或者细胞壁上面的脂质
        • 注意：某些脂溶性试剂会破坏细胞结构和产物生化性质。
    • 酶解法
      • 溶菌酶破坏β－1，4－糖苷键，破坏细菌细胞壁；纤维素酶破坏植物细胞壁；酵母需要多种酶复合作用
      • 自溶作用：改变生长环境，诱发菌体本身产生自溶酶，酶解细胞壁。
      • 特点：专一性强，作用条件温和，反应迅速；价格昂贵、通用型差、有局限性，不利于大量目的产物提取，酶也是蛋白质，有可能引入杂质。
    • 干燥法
    • 冷热交替法
      • 90℃维持数分钟，放入冰水冷却，反复多次，细胞破碎
  • 细胞破碎率的评价
    • 直接计数法：格兰仕染色后计数破碎前和破碎后的细胞数量，即可计算破碎率。误差较大
    • 间接计数法：测定破碎后的悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（可溶性蛋白、酶等）