重组DNA技术简介人类基因组

这是一篇关于重组DNA技术简介人类基因组的思维导图。重组DNA技术一般指基因工程。基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的遗传技术。

重组DNA技术简介

• 基因工程的应用及成果简介
  • 疫苗、胰岛素及生物制品
  • 动物基因工程与畜禽品种改良
  • 在遗传病的基因诊断和治疗中的作用
• 遗传工程的风险和伦理学问题
• 基因克隆的质粒载体
  • 载体定义
    • 能插入核酸片段、携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子
  • 载体分类
    • 克隆载体
      • 定义
        • 在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。
      • 分类
        • 质粒
        • 噬菌体
        • 病毒
      • 性质
        • 1、具备复制原点，可独立自主复制； 2、有可供选择的遗传标记（抗性基因、显色反应），以便于对阳性克隆的鉴别和筛选。 3、具有若干限制酶单一切割位点，且位于载体复制的非必需区，以便插入外源基因后不影响复制。 4、易导入宿主细胞，产生生物学效应。 5、具有生物安全性，胞内不发生重组和转移，胞外不能自由扩散。
    • 表达载体
      • 是适合在受体细胞中表达外源基因的载体。
    • 穿梭载体
      • 是在原核和真核中都可以复制和表达的载体。
• 重组DNA的基本步骤
  • 获得目的基因
    • 限制性内切酶酶切产生待克隆的DNA片段
    • 人工合成DNA
    • 反转录酶酶促合成法
    • PCR反应扩增特定的基因片段
  • DNA分子的体外重组
    • 粘性末端连接法
      • 载体与外源基因都有相同限制酶的识别位点——产生相同的粘性末端
    • 接头连接法
      • 外源基因两端加接头后，再酶切——产生相同的粘性末端
    • 衔接物连接法
      • 外源基因先与衔接物的平末端连接，粘性末端与载体链接
    • 均聚物加尾法
      • 载体与外源基因都没有酶切位点，用末端转移酶产生相匹配的粘性末端
    • 平末端连接法
      • 载体与外源基因都是平末端，用T4DNA连接酶链接。缺点：效率低且不易切割
  • 重组DNA分子导入宿主细胞和筛选鉴定：
    • 重组DNA引入宿主细胞
      • 外源基因导入原核细胞
        • 感受态细胞
      • 导入哺乳动物细胞
        • 微量注射法、电穿孔法及逆转录病毒法。
    • 重组体克隆的筛选鉴定
      • 重组体表型特征的鉴定
        • (1) 抗生素平板法 (2) 插入失活法 (3) 插入表达法 (4) β-半乳糖苷酶显色反应法
      • 重组DNA分子结构特征的鉴定
        • (1)菌落（或噬菌斑）原位杂交 (2) 内切酶图谱鉴定 (3) PCR 鉴定 (4) DNA序列测定
      • 外源基因表达产物的鉴定
        • (1)表达产物免疫活性测定 (2)表达产物生物活性检查 (3)表达产物氨基酸序列测定
• 基因工程主要的工具酶
  • 内切酶：把DNA长链切割为短的片段
  • 连接酶：将2段DNA片段拼接起来
  • 聚合酶：催化合成形成核酸链
  • 末端转移酶：片段末端加接多聚核苷酸
  • 核酸酶：水解酶，非专一性
  • 反向转录酶：逆转录酶
• 基因工程的相关技术
  • 主要原理
    • 用人工的方法，将不同来源的基因在体外“重新组合”，构建杂种DNA分子，然后导入活细胞并表达，以改变生物原有的遗传特性、创造新品种(系)或新的生物材料的技术。
  • DNA的变性与复性
  • 分子探针寻找特定基因
  • Southern印迹与Northern印迹
  • 原位杂交
  • PCR
    • 变性
    • 退火(复性)
    • 延伸