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四种基因工程
大肠杆菌基因工程
大肠杆菌表达外源基因的优缺点：优势：1、全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架。2、基因克隆表达系统成熟完善。3、繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定。4、被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。 劣势：1、缺乏对真核生物蛋白质的复性功能。2、缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统。3、内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白。4、细胞周质内含有种类繁多的内毒素。
大肠杆菌表达载体
构成：普通质粒元件：ori，选择标记，MCS 表达元件：阻遏基因（I），操纵基因（O），启动子（P），核糖体结合位点RBS（包括SD序列），转录终止子。
1、融合型蛋白表达载体：载体的启动子序列和S D序列与目的基因之间存在A T G，翻译从目的基因上游载体的A T G处开始，表达出包括载体DNA序列编码的一段短肽和外源蛋白融合在一起的融合蛋白。此段肽可以充当保护剂，避免重组蛋白被水解。
2、非融合型蛋白表达载体：由目的基因的编码基因决定，并不与细菌的任何蛋白质或多肽融合在一起表达，易被降解。
3、分泌型蛋白表达载体：将信号肽序列的DNA插入到载体的启动子和目的基因之间可以使目的基因编码的蛋白质分泌到细胞外，防止水解利于纯化。
概要
大肠杆菌中目的基因的高效表达策略
包涵体型蛋白表达策略
在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密的集聚在一起形成无膜包裹、裸露蛋白结构。这种水不溶性的结构称为包涵体，在包质或周质中。（外源蛋白为主要成分，与RNA聚合酶，核糖核蛋白，外膜蛋白，载体编码蛋白，RNA，DNA，脂多糖共同组成）
优点：1、能简化外源基因表达产物的分离操作。2、能在一定程度上保持表达产物的结构稳定。 缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象的目标蛋白。
溶解和变性：清洗剂，促溶剂，混合溶剂，极端pH。（拆开错配的二硫键和次级键） 复性和重折叠：一步稀释法，分段稀释法，试剂添加法，蛋白修饰法，产物隔离法，分子伴侣法。（将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠，通过，次级键的形成使蛋白质复性。
融合型蛋白表达策略
外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。
通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收外源蛋白。
目的蛋白的回收：1、化学断裂法：用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰。优点是回收率高（可达85%以上），专一性强，而且所产生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，与真核生物细胞中成熟表达产物较为接近。如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法。 2、酶促裂解法：多残基位点。
分泌型蛋白表达策略
外源蛋白在大肠杆菌中的表达定位分为两种形式，即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中，或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质中，甚至穿过外膜进入培养基中。
蛋白质产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件
如果肽链内疏水氨基酸残基过多，穿膜易滞留在细胞膜内，成为膜蛋白组分。可插入组氨酸六聚体结构或与分子伴侣基因共表达。培养条件也会影响蛋白质表达水平，如利用低温培养低强度启动子低诱导剂有利于分泌型蛋白表达，但得率低。
寡聚型蛋白表达策略
通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量的有效方法是通过构建寡聚串联型异源蛋白表达载体，即将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取带单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略。
优缺点：1、目的蛋白高效表达。在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的的基因的拷贝数，可以在一定程度上改善表达量。2、稳定表达小分子短肽。短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短，串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空间结构，因而抗蛋白酶，降解的能力大幅度提高。3、目的产物回收困难。寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获得最终分子，但裂解后的短肽分子容易出现序列不均一性。
整合型蛋白表达策略
是将要表达的外源基因整合到受体菌的受体染色体特定位置上，使之成为染色体结构的一部分，而稳定的遗传和表达。
实现外源基因与宿主细胞染色体整合式，根据DNA同源重组的原理，在待整合的外援基因两侧分别组合一段与染色体DNA完全同源的系列。
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
胰岛素的结构：包括A B两条链51个氨基酸( A链21，B链30）
工程菌的构建：1、A链和B链分别表达法。2 、A链和B链同时表达法。3、融合表达法。
基因工程菌的大规模培养与遗传不稳定性
大规模培养
与普通微生物菌株相比，基因工程菌株的不同点：1、由菌株控制的外源表达可能会对菌株的生长和分裂造成负面影响。2、重组质粒容易发生丢失，重排和修饰，遗传不稳定。3、发酵规模小，多小于10L。
培养方式：分批培养，连续培养，分批补料培养，透析培养，固定化培养。
遗传不稳定：含有重组质粒的基因工程菌在菌体细胞繁殖分裂过程中会产生不含有重组质粒的子代菌或后代菌株中含有变异的重组质粒。
原因：1、细胞分裂时重组质粒分配不均或核酸酶降解。2、重组质粒DNA的结构发生改变或表达功能丧失｡3、重组菌长势低于非重组菌，宿主菌对重组质粒排斥。
对策：1、改进受体系统，增强载体稳定性。2、培养基中加入抗生素，加大选择压力。3、使用营养缺陷型受体菌，质粒载体与受体互补。4、重组质粒DNA的结构发生改变和表达功能丧失。5、适宜的培养条件。
酵母基因工程
酵母表达外源基因的优势：既有原核生物生长快、遗传操作简单的特点，又有哺乳动物细胞的翻译后加工和修饰功能。表达真核生物的生物活性蛋白时安全，不含特异性的病毒，不产生内毒素，大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉，具有真核蛋白翻译后加工系统。 缺点：表达效率低，受密码子偏好影响等。
改造
天然酵母宿主菌缺点：筛选不方便，重组蛋白产率低且易降解，分泌功能弱，与人源化糖基化修饰存在差异。
改造：1、构建筛选标记是宿主菌便于选择。2、诱导基因突变货超量表达相关基因。3、降低宿主菌重组异源蛋白的降解。4、促进宿主菌中重组蛋白的折叠。5、协助宿主菌中重组蛋白的运输。6、改善重组蛋白糖基化的宿主菌。
酵母载体系统
载体：酵母野生型质粒，原核生物质粒载体的抗性基因、复制起点，宿主染色体DNA上自主复制序列（ARS），着丝粒序列（CEN），端粒序列（TEL）。
DNA复制区
大肠杆菌复制起始序列
酵母自主复制序列
选择标记
营养缺陷型选择标记
显性标记
有丝分裂稳定区：酵母染色体着丝粒片段
表达盒
启动子
分泌信号序列
终止子
载体类型
自主复制型质粒载体（YRp）
构件：酵母基因组的DNA复制起始区，选择标记，克隆位点。
特点：1、在酵母中自我复制。2、高转化率。3、高拷贝数。4、质粒载体分配不均。
附加型载体（YEp）
构件：大肠杆菌质粒，2ｕ质粒，选择标记。
特点：1、大肠杆菌-酵母穿梭质粒。2、以质粒形式存在。3、高转化活性。4、稳定（STB序列）。5、高拷贝数（25-100分子/细胞）。
着丝粒型质粒载体（YCp）
在YRp中插入着丝粒序列。
特点：稳定，低拷贝（1-2分子/细胞）
酵母人工染色体载体（YAC）
构件：ARS，CEN，TEL，酵母选择标记，大肠杆菌复制子，大肠杆菌选择标记。
特点：线性双链，单拷贝，稳定。
整合型质粒载体（YIp）
构件：大肠杆菌质粒，酵母染色体DNA特定序列，标记基因。
特点：不能在酵母中自主复制，含有整合介导区。
酿酒酵母细胞表面展示表达载体
表面展示是使表达的多肽以融合蛋白形式展现在核糖体、病毒或细胞表面，保持相对独立的空间结构和生物活性。用于研究多肽性质，相互识别和作用，筛选具有特定功能的多肽。
重组子在酵母中的转化，筛选和表达。
转化：原生质体转化法，一价碱性金属离子转化法，PEG1000转化法，电击法。
筛选标记：营养缺陷型标记（氨基酸，核苷酸），显性标记（抗性或毒性蛋白抗体蛋白），自选择系统。
表达与加工修饰：转入是原核与真核生物中异源蛋白生产的一个关键步骤，因此强大和可控的启动子是有效生产异源蛋白的关键工具。
分泌与加工修饰：避免毒害宿主细胞，简化蛋白纯化过程，已进行蛋白翻译后修饰。
利用重组酵母生产乙肝疫苗
产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母的构建：主要原理是将S多肽的编码基因置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒形式存在，平均颗粒直径22nm,其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。
产乙肝表面抗原的重组巴巴斯德赤酵母的构建
巴斯德赤酵母是甲基营养型酵母表达系统，相对于酿酒酵母而言，其具有能将构建好的重组质粒通过电转化，整合入自己的染色体系统，避免了由于传代或培养时间过长，引起质粒丢失，致使工程菌不稳定。
巴斯德赤酵母是一种嗜甲醇酵母，在AOX1启动子调控下表达外源基因时，可通过调节甲醇浓度适时地控制表达过程。甲醇浓度过低起不到诱导作用，过高又会损害酵母细胞活性，实验证明，先用终浓度为0.5%的甲醇诱导24h，再将甲醇终浓度增至1%重组的s蛋白表达量最大，抗原性能达到最强。
构建过程
高等植物基因工程
植物基因工程就是利用基因工程技术将外源生物基因通过遗传转化等技术导入植物基因组内，改变植物的某些遗传转化等技术导入植物基因组内，改变植物的某些遗传特性，培育具有优质、高产、抗旱、抗涝、抗盐田、抗病毒、抗虫、抗除草剂等特性的作物新品种。或者利用转基因植物或离体培养的细胞来生产外源基因的表达产物。
广义的植物基因工程：上游基因操作，遗传转化，受体菌筛选，受体表型分析和分离。
高等植物基因工程
高等植物转基因技术
转基因植株
农作物遗传性状改良
高等植物细胞表达技术
植物工程细胞
蛋白质多肽物质大规模生产
高等植物遗传学特征
低等植物：无根、茎、叶等分化器官，合子不经胚直接发育为个体。藻类，地衣。
高等植物：含根茎叶花果分化器官，合子经胚再发育为个体。苔藓门，蕨类门，裸子门，被子门。
遗传操作简易性：大多数高等植物具有自我授精的遗传特征，通常能产生大量后代；授精范围广，速度快，效率高。因此，即便是频率极低的基因突变和重组事件，其遗传后果也易被观察。
整株植物的全能性：植物每个细胞都包含该物种的全部遗传信息，理论上具备发育成完整植株的遗传能力。
染色体的多倍性：在组织培养过程中呈现出较高的遗传不稳定性，导致体细胞变异。
受体系统：用于基因转化的外植体（指植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器官，组织，细胞和原生质体等），能接受外源DNA整合、转化，并通过组织培养或其它途径，获得高效、稳定的无性系，可筛选出具有相应标记基因的再生系统。
愈伤组织受体系统
胚性愈伤组织，非胚性愈伤组织
特点：1、易接受外源DNA，转化效率高。2、多种外植体都可以产生愈伤组织。3、愈伤组织可以继代扩繁。4、嵌合体比例高，筛选na难度增加。5、遗传稳定性差。
原生质体受体系统：特点：1、外源DNA易导入。2、嵌合体少。3、适用于各种转化方法。4、变异大，遗传稳定差。5、原生质体培养难度大、周期长、和再生频率低。
种质受体系统：以植物的生殖细胞（花粉粒，卵细胞或种子）为受体进行基因转化的系统。
胚状体受体系统：胚状体也称为体细胞胚，是指离体条件下没有经过受精过程，所形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构。
直接分化芽受体系统
直接分化芽：指外植体细胞不经过愈伤组织阶段而直接分化形成的不定芽。
特点：1、体细胞无性系变异小，导入的外源目的基因可稳定遗传。2、基因转化的操作简单、周期短。3、嵌合体多。4、技术难度大，不定芽量少，因此基因转化频率低于其它几种受体系统。
农杆菌Ti质粒介导的高等植物转基因技术
Ti质粒
结构：整个质粒160-240kb，其中T-DNA 15-30kb,tms-合成吲哚乙酸，tmr-植物分裂素，tmt-冠瘿碱。
改造:1、 除去T-DNA上的生长素（tms)和分裂素(tmr)生物合成基因。2、除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt)。3、除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度。4、安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作。5、安装植物细胞的筛选标记。6、安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。
农杆菌载体构建
共整合载体系统：指中间载体与改造后的卸甲载体（将根癌农杆菌Ti质粒上T-DNA中的致瘤基因全部删除以消去对植物的致瘤性，保留vir 基因区，保留其两侧边界与T-DNA准确转移所必须的25个碱基序列，保留其基因转移的能力，这样构成的载体称为卸甲载体）之间通过同源重组所产生的一种复合型的载体。
双元载体系统：由两个分别含有T-DNA和vir 区的相容性的微型Ti质粒和辅助Ti质粒构成的，T-DNA和vir 基因在两个独立的质粒上通过反式激活T-DNA转移到植物细胞基因组内。
Ti质粒介导的整合转化分子机制
致瘤过程：农杆菌对受体的识别—农杆菌附着到植物受体细胞—诱导启动毒性区基因表达—类似接合孔复合体的合成与装配--T-DNA的加工和转运--T-DNA的整合。
基因表达系统
外源基因的四环素诱导系统
Tet-off 型四环素阻遏系统：由调节表达载体（四环素阻遏蛋白基因表达盒）和反应表达载体（四环素阻遏型目的基因表达盒）组成。
Tet- on型四环素诱导系统
优点：1、Tet系统具有低本底与高诱导倍数的特点。2、低剂量的诱导剂为Tet即可调节基因表达，无强毒。3、诱导时间短，可逆。4、适用于转基因研究。
外源基因的乙醇诱导系统
外源基因的类固醇诱导系统
肾上腺糖皮质激素诱导系统
蜕皮激素诱导系统
应用：1、利用转基因植物生产药用蛋白。2、抗虫害的转基因植物。3、转基因黄金大米。4、抗除草剂转基因植物育种。
哺乳动物基因工程
哺乳动物基因工程
哺乳动物转基因技术
转基因动物个体
转基因动物是借助转基因技术将外源目的基因导入生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体染色体上整合，改变动物的遗传组成，从而培养出具有表达新性状的动物个体。
转基因动物的应用：对生命现象的本质进行更深层次的了解；建立多种疾病动物模型、研究疾病的发病机制及治疗方法；作为生产特定蛋白质的生物反应器；提高家养动物的育种效率；生产用于人体器官移植的动物器官。
哺乳动物遗传性状改良，服务畜牧业生产和医疗。
哺乳动物细胞基因表达技术
动物工程细胞
蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型。
受体系统
哺乳动物细胞的生物学特征：锚地依赖性，血清依赖性，接触抑制性，形态依赖性。
高效表达外源基因的哺乳动物受体细胞应该具备的条件：1、细胞系特征。丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大规模培养。2、遗传稳定性。外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存。3、合适的标记。便于转化株的筛选和维持。4、生长快且齐。分裂周期短，生长均一，便于控制。5、安全性能好。不合成分泌致病物质，不致癌。
常用的受体细胞：中国仓鼠卵巢细胞（CHO）；非洲绿猴肾细胞（CV-1）；地鼠肾细胞（BHK）；RIII小鼠乳腺肿瘤细胞（C127）；西班牙犬内皮细胞株（MDCK）。
遗传标记：胸腺嘧啶核苷激酶编码基因缺陷的受体细胞；次黄嘌呤磷酸转移酶编码基因缺陷的受体细胞；含有二氢叶酸还原酶编码基因缺陷的受体细胞。
载体系统
表达载体必须具备的功能：1、为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。2、为外源基因提供进入受体细胞内复制或整合的能力。3、为外源基因提供进入受体细胞内的高效表达提供相应的调控元件和终止序列。
质粒型载体
通用型表达载体：可高效表达，一般无物种或细胞类型的特异性，其启动子可以驱动目的基因在同物种或不同物种中所有类型细胞（组织）表达。
组织特异表达载体：某些基因只在特定的组织中表达，这些基因受特定的启动子调控，驱动目的基因在特定组织中表达。
病毒型载体
具备条件：能携带外源基因并能够包装成病毒颗粒；介导外源基因的转移和表达；对机体不致病。
分类： 整合型（SV40、反转录病毒载体、慢病毒载体等）：整合入宿主染色体，随染色体复制而复制，并可持续表达外源基因，但安全性低，插入外源基因容易使宿主染色体产生诱变。 游离型（腺病毒载体，痘苗病毒载体）
SV40 DNA载体的特点：1、基因表达好。外源基因能高效表达。2、基因重排高。病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象。3、宿主范围窄。只能转染猴细胞。4、装载量较小。
反转录病毒载体
表达外源基因操作流程：将目的基因克隆至反转录病毒穿梭载体上—转化大肠杆菌扩增病毒载体DNA—病毒载体DNA转染包装细胞—制备高浓度病毒颗粒—感染受体细胞表达目的蛋白。
优点：宿主范围广；高效感染；稳定整合；稳定表达；免疫原性低。
缺点：只感染分裂细胞；存在的外源片段小；随机整合；有致癌风险。
腺病毒载体：特点：1、基因重排低。外源基因与病毒DNA重组后能稳定复制几个周期。2、安全性能好，不整合人的染色体DNA，不会导致恶性肿瘤。3、宿主范围广。对受体细胞是否处于分裂期要求不严格。4、使用效果好。外援基因在整体上容易高效表达。
定向打靶载体
基因打靶是一种定向改变生物活体遗传信息的操作技术。定向修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而研究基因功能、提供相关的疾病治疗和建立新药筛选评价模型等。
定向修饰：基因灭活；点突变引入；缺失突变；外源基因定位引入；染色体组大片段删除。
敲降载体：作用是使受体细胞特定的靶基因m RNA 发生降解，从而使靶基因的表达水平大幅度降低。多数的敲降载体依赖三种。RNA聚合酶III启动子中的一种，操纵一段小发夹RNA（shRNA)在哺乳动物细胞中的表达，shRNA会自动被加工成为siRNA ，从而引发基因沉默或者表达抑制。
敲除载体：在DNA水平对受体细胞内靶基因实施编辑与修饰，主要作用是破坏靶细胞中特定基因表达结构，使其不能表达，具有位点特异性。
同源重组：转染了同源重组结构的细胞，其外源基因有两种去向，即基因组中整合了外源基因的细胞和没有整合外源基因的细胞通过在培养基中添加G418和GANC进行筛选定点整合的细胞系。
基因敲入：利用同源重组原理在个体基因组的特定位点上插入某个或某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。
锌指核酸酶：有一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。
TALENs：是转录激活因子类似效应物核酸酶｡一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，借助于转录激活因子类似效应物来识别特异性DNA碱基对。
CRISPR-Cas系统：成簇的规律间隔的短回文重复序列。
Cre-LoxP 重组酶系统：LoxP序列是有两个13bp 反向重复序列和中间间隔的8bp 序列共同组成，8bp 的间隔序列同时也确定了LoxP 的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合,13bp 反向重复序列是Cre酶的结合域。
基因导入方法
物理：电穿孔；显微注射；基因枪转化法；超声波转化法；血影细胞介导法。
化学：氯化钙转移法；磷酸钙共沉淀法；脂质体介导法等。
生物：病毒转染法。
利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白
目的基因在哺乳动物细胞如C H O中高效表达受到目的基因整合的染色体区域、目的基因拷贝倍数、目的基因的转录、翻译和翻译后加工修饰效率等因素影响。
改造
载体改造
转录前改造：通过强化基因扩增高效表达外源基因。
转录水平的改造：在载体上安装病毒或细胞来源的强启动子以及有效的翻译元件，也是使外源基因高效表达的一种手段。绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体上携带内含子结构，因为mRNA前体的剪切能促进成熟，mRNA向胞质的运输，有利于翻译。有的还含有各种信号肽序列。
基因改造
利用密码子的偏好性：在不改变蛋白质编码序列的前提下，尽量使用C H O细胞常用的密码子对基因进行改造。
尽量使用基因组DNA：基因组DNA比cDNA 表达量更高。
宿主细胞改造
使CHO细胞在无血清培养基中自分泌生长
控制CHO细胞增殖速率
利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白的实例：1、生产人源化小鼠抗体。2、生产人组织型纤溶酶原激活物。