导图社区 《细胞生物学》细胞生物学研究方法
这是一篇关于《细胞生物学》细胞生物学研究方法的思维导图。在检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面有广泛的应用价值。
编辑于2021-06-29 10:54:29细胞生物学研究方法
显微成像技术
最早的光学显微镜:Z.Janssen&H.Janssen (1590)
光学和电子显微镜成像原理
镜像形成三要素
照明系统
光学显微镜:可见光
电子显微镜:电子束
被观察的样品
聚焦和成像的透镜系统
光学显微镜:玻璃透镜,可直接通过目镜观察镜像
电子显微镜:电磁透镜,通过 荧光屏观察镜像
原理
光学:利用凸透镜的放大成像原理,将人眼不能分辨的微小物体放大到人眼能分辨的尺寸
电子:利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态,即用极狭窄的电子束去扫描样品,通过电子束与样品的相互作用产生放大的效应
基础知识
分辨率
分辨距离:能分辨出相邻两个物点间最小距离的能力
分辨距离越小,分辨率越高
一般规定:显微镜或人眼在25cm明视距离处,能清楚的分辨被检物体细微结构最小间隔的能力
计算公式:分辨率(r)=0.61λ/ NA NA是显微镜数值孔径
提高分辨率
角孔径越大,进入物镜的光越多
介质折射率越大,数值孔径越大
常用的光学显微镜
普通双筒显微镜:同时用两眼观察,有较强的立体感
荧光显微镜
工作原理:利用紫外线发生装置发生强烈的紫外线光源,通过照明设备把显微固定的切片或活染的细胞透视出来
发光现象
自发荧光:叶绿素、血红素经紫外线照射能发出红色的荧光
诱发荧光:物体经荧光染料染色后再通过紫外线照射发出荧光
相差显微镜
优点:可观察无色、透明、活细胞中的结构
原理:利用光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅差,表现为明与暗的对比,使肉眼得以观察到无色透明物体的细节
暗视野显微镜
主要观察物体的轮廓,适合观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和霉菌等
倒置显微镜
组成与普通显微镜一样,物镜与载物台间的工作距离颠倒
光学显微镜样品制备
样品的固定
目的:杀死细胞,稳定细胞的化学成分,并且使样品硬化以便在进一步的处理和切片时不会受到破坏
用乙醛或戊二醛做固定剂,能够与蛋白质的游离氨基形成共价键,从而将临近的蛋白质分子牢固地交联在一起
包埋与切片
液态石蜡或树脂做包埋剂,使之渗入整块组织,然后将之硬化成固体包埋块
切片机切片,光学显微镜观察切片厚度为1-10μm
染色
目的:给细胞不同组分带上可区别的颜色特征
例子
苏木精对负电荷分子有亲和性,能显示出细胞内核酸的分布
伊红可使细胞质染色
苏丹染料的乙醇饱和浓度能使脂肪着色
放射自显影
用感光胶片测定细胞内某种被放射性标记的物质在细胞固定时所在的位置
过程:生物材料的标记→自显影样品的制备→自显影的制作→曝光→显影→定影→观察与分析(定位及放射性测量)
电子显微镜
透射电子显微镜
原理
由电子枪发射出来的电子束,在真空通道中沿着镜体光轴穿越聚光镜,通过聚光镜将之会聚成一束尖细、明亮而又均匀的光斑,照射在样品室内的样品上;透过样品后的电子束携带有样品内部的结构信息,样品内致密处透过的电子量少,稀疏处透过的电子量多;经过物镜的会聚调焦和初级放大后,电子束进入下级的中间透镜和第1、第2投影镜进行综合放大成像,最终被放大了的电子影像投射在观察室内的荧光屏板上;荧光屏将电子影像转化为可见光影像以供使用者观察
扫描电子显微镜
不需要成象透镜, 其图象是按一定时间、空间顺序逐点形成并在镜体外显像管上显示
扫描透射电镜与高压电镜
细胞化学技术
酶细胞化学技术
基本原理
将细胞内的酶和底物相互作用,再将酶反应的产物作为反应物质,在酶的作用部位进行捕捉,使其在显微镜下具有可见性
捕捉反应
目的:形成显微镜下可见的最终反应产物
常见方法:金属盐沉淀法和嗜锇性物质生成法
免疫细胞化学技术
免疫荧光技术
将免疫学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布,由于荧光素所发出的荧光可在荧光显微镜下检出,从而可对抗原进行细胞定位
免疫电镜
其他细胞化学技术
显微分光光度术
将显微镜技术与分光光度计结合起来的技术
显微荧光光度术
对细胞内原有能发光的物质或对细胞内各种化学成分用荧光探针标记后进行定位、定性和定量地测定
核磁共振技术
直接研究溶液和活细胞中小分子质量的蛋白质、核酸以及其他分子的结构,而不损伤细胞
细胞分选技术
流式细胞仪结构
激光光源:可发出合适波长的光
流室:生物颗粒在此与鞘液相混
讯号检测器:由光学透镜装置和光电倍增管组成,接收放大各种光讯号,并把它们转变成电泳冲讯号
讯号分析部件:微型电子计算机装置,对讯号做出分析
细胞分选
当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中,被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液,在鞘液的包裹和推动下,细胞被排成单列,以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体,充电后振动,使喷出的液流断裂为均匀的液滴,待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷,当液滴流经过带有几千伏的偏转板时,在高压电场的作用下偏转,落入各自的收集容器中,没有充电的液滴落入中间的废液容器,从而实现细胞的分离
染色体分选
将结合有荧光染料的探针同染色体一起温育,使探针同特异染色体杂交,形成稳定的杂交体,这样染色体就被带上了荧光标记,稀释后送入流式细胞计的流室,然后与细胞分选过程一样将特异的染色体分选出来
使用的探针是同所感兴趣染色体互补的寡聚核苷酸
分离技术
离心分离技术
速度离心
原理:在一定的离心速度下,不同大小的细胞器由于体积的不同,沉降速度不同。体积大沉降快,体积小沉降慢
分类
差速离心
逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低,让较大的颗粒沉降到管底,小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀,改用较高的离心速度离心悬浮液,将较小的颗粒沉降,以此类推,达到分离不同大小颗粒的目的
移动区带离心
用蔗糖或甘油制备轻微的连续密度,然后将待分离的样品加在离心管的最上层,形成一狭窄的带,再通过较长时间的离心。在离心过程中,大小、形状、密度不同的颗粒就会分开,最后收集各区带得到要分离的物质
分离介质对被分离的物质必须是中性无害的,并且密度梯度较低,底部的密度比管顶部的密度大,建立密度梯度的目的是防止扩散
待分离颗粒的密度比离心管中任何部分介质的密度都要大
等密度离心
分离依据:被分离颗粒的密度差异
蔗糖或者甘油(它们的最大密度是1.3g/cm3)通常可用于分离膜结合的细胞器,如高尔基体、内质网、溶酶体和线粒体
离心分离密度大于1.3g/cm3的样品,如DNA、RNA,需要使用密度比蔗糖和甘油大的介质
重金属盐氯化铯(CsCl)是使用的最好的离心介质,它在离心场中可自行调节形成浓度梯度,并能保持稳定。
层析分离技术
凝胶过滤层析(排阻层析、分子筛法)
根据蛋白质的大小和形状,即蛋白质质量进行分离纯化
分子质量大的被先洗脱出来
亲和层析
将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基(也称为配体),与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂,再用此亲和吸附剂填充色谱柱,当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时,亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质,而其他的蛋白质及杂质不被吸附,从色谱柱中流出,使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附,即可获得纯化的目的产物
离子交换层析
根据在一定pH 条件下,蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法
细胞工程技术
细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域,利用细胞生物学的原理和方法,结合工程学的技术手段,按照人们预先的设计,有计划地改变或创造细胞遗传性的技术
细胞培养
在体外模拟体内的生理环境,培养从机体中取出的细胞,并使之生存和生长的技术
体外培养条件
三环节
营养
一般使用合成培养基,在内添加天然成分如血清
牛血清为主,血清中含有多种促细胞生长因子和一些生物活性的物质
生存环境
无菌环境、合适温度、一定渗透压、气体环境(二氧化碳维持培养液酸碱度,氧气)
废物的排除
定期更换培养液
原代培养
第一代至第十代以内的培养细胞
组织块培养
将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上,加入培养基后进行培养
分散培养
将组织块用机械法或化学法使细胞分散
细胞系和细胞株
原代培养物经首次传代成功后即为细胞系
有限细胞系:不能继续传代或传代次数有限
连续细胞系:可连续培养
从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群为细胞株
动物细胞培养方法
贴壁培养
分散的细胞悬浮在培养瓶中很快就贴附在瓶壁上为细胞贴壁,贴壁后的细胞形态形成多态性,呈单层生长(单层细胞培养)
单层细胞培养保持接触抑制的特性
悬浮培养
不贴壁,一致悬浮在培养液中
植物组织培养
愈伤组织可再分化,形成芽、根,再生成植株
植物原生质体培养
原生质体:脱去细胞壁的细胞
将原生质体放在合适的培养基上,经过诱导分化可以重新长成植株
细胞融合与单克隆抗体技术
细胞融合
自发或人工诱导下,两个不同基因的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞
单克隆抗体技术
B淋巴细胞和瘤细胞融合后的杂交瘤细胞既能产生抗体又能无限增殖
显微操作术
用于细胞核移植、基因注入、染色体微切和胚胎切割等手术
动物细胞核移植克隆技术
多利羊
分子生物学方法
基因工程技术
基因克隆技术
分:分离制备合格的待操作的DNA(包括作为载体的DNA和欲克隆DNA)
切:用序列特异的限制性核酸内切酶切开载体DNA或切出目的基因
连:用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来形成重组DNA分子
转:通过特殊的方法将重组DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增
选:从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体
基本特点
基因工程的操作
细胞水平上的表达
PCR(聚合酶链式反应)技术
基本原理:DNA的半保留复制
过程
引物设计和合成
DNA模板的制备
PCR反应
产物的分离和纯化
选择性基因剔除和转基因鼠
乳腺生物反应器技术
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