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王镜岩 生物化学 上册 7、酶动力学
王镜岩 生物化学 上册 第七章、酶动力学，包括化学动力学基础、底物浓度对酶促反应速率的影响、酶的抑制作用、温度对酶促反应的影响、pH对酶促反应的影响、激活剂对酶促反应的影响等知识点。
编辑于2022-07-22 16:48:57- 王镜岩
- 酶动力学
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第七章酶动力学
酶促反应动力学：是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。
一、化学动力学基础
（一）化学反应速率及其测定
⭐️反应速率：是以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。用瞬时速率表示反应速率。
（二）反应分子数与反应级数（实际应用上常采用反应级数）
· 在化学动力学中研究化学反应速率与反应物浓度的关系时，有两种分类方法：反应分子数及反应级数来分类。
反应分子数：反应中真正相互作用的分子的数目。
· 反应级数：化学反应服从那种分子反应速率方程式即为几级反应。如：（1）某反应总反应速率与浓度关系以单分子反应速率方程式表示 → 一级反应； （2）若用双分子反应速率方程式表示 → 二级反应；（3）把与反应速率与反应物浓度无关的反应 → 零级反应。
（三）各级反应的特征
⭐️半衰期：一半反应物转为产物所需的时间。记作t1/2。
二 、底物浓度对酶促反应速率的影响
（一）中间复合物学说
定义：① 酶催化某一化学反应时，酶首先和底物结合生成中间复合物(ES)，中间产物不稳定，极为活泼，易发生化学反应而生成产物(P)，并释放出酶。② 酶催化反应可以写成：S（底物）+ E（酶） ←→ ES（中间产物） ←→ P（反应产物）+E③ 表明反应速率取决于中间产物的浓度，当aq中的酶全部被饱和而转变成中间产物时，再增加底物浓度也无法改变稳定的最大反应速率。
· ES已被电子显微镜和X射线晶体结构分析直接观察到。
(二)酶促反应的动力学方程
1、米式方程 【单底物反应的动力学】
2、Briggs-Haldane修正的米氏方程【稳态模型】
● 稳态是反应系统中ES（中间产物）生成与分解速率相等时，ES浓度保持不变的这种状态。
★ 米式方程表示一个酶促反应的起始速度（v）与底物浓度（S）关系的速率方程。
★ Km值（米氏常数）：是当酶反应速率达到最大反应速率的一半时的底物浓度。因此, Km的单位为mol/L。
3、动力学参数的意义 【米式方程动力学——双曲线‼️】
（1）米式常数的意义
（1）Km是酶的一个特征性常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关,但受到底物、反应温度、pH、离子强度等的影响。【某一酶促反应，一定条件下有特定的Km值 → 鉴别酶】
（2）Km值可以判断酶的专一性和天然底物。【 Km值最小的底物 → 天然底物 】
（3）Km可表示酶和底物结合的亲和力大小。 【1/Km ↓，Km ↑，亲和力↓】
（4）若已知某个酶的Km值，可以计算在某一个底物浓度时，反应速率相当于最大反应速率Vmax的百分率。
（5）Km可以帮助推断某一反应的方向和途径、有助于寻找代谢限速步骤【Km ↑，V ↓，为限速反应】、可推断多酶体系中的优势途径【Km值 ↓ 的酶反应比较占优势】。
（2）Vmax和K2(Kcat)的意义
● Kcat：也称为转换数（TN），是酶最大催化活力的度量。定义为当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子将底物转换产物的分子数。【 Kcat越大，酶催化效率越高】
· 在一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一 个常数。同一种酶对不同底物的Vmax 也不同，pH、 温度和离子强度等因素也影响Vmax的数值。
（3）Kcat/Km（催化效率指数）
4、利用作图法测定Km和Vmax
· 基本原则:将米氏方程变化成相当于y=ax+b 的直线方程，再用作图法求出Km。
a.双倒数作图法：将米式方程两侧取倒。x轴和y轴上的截距是-1/Km和1/V0.
(三)多底物的酶促反应动力学
三、酶的抑制作用
概念
⭐️失活作用（inactivation）：凡使酶蛋白变性而引起的酶活力丧失的作用。
⭐️抑制作用 (inhibition)：由于酶必需基团化学性质改变，使酶的活性降低或丧失，但并不引起酶蛋白变性的作用。
🔺抑制剂(inhibitor)【 I 】：能够引起抑制作用的化合物。【抑制剂对酶的抑制作用是有选择性的，而变性剂则无】
（一) 抑制程度的表示方法
（二) 抑制作用的类型及动力学
● 酶的活性中心：酶与底物只能在一个区域结合，酶分子中能与底物结合并发生催化作用的局部空间结构称为酶的活性中心。它具有必需基团、结合基团和催化基团。
1、可逆的抑制作用
⭐️ 可逆抑制作用：抑制剂与酶蛋白以非共价键方式结合，引起酶活性降低或暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。
（1）竞争性抑制
⭐️概念：某些 I 的化学结构与 S 相似，因而能与底物竞争与酶活性中心结合。当 I 与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，酶促反应被抑制。
★ 特点：① 抑制程度取决于 S 与 I 的相对浓度； ② 抑制作用可通过增大底物浓度而解除。
● 举例：丙二酸和戊二酸与琥珀酸脱氢酶结合，但不能催化脱氢。
★ 动力学：
★ 加入竞争性抑制剂后，Km 变大，Vmax不变。
① Km变大，K’m > Km，且k’m随 [I] 的↑而↑； ② 抑制分数与 [I] 成正比，与 [S] 成反比。
（2）非竞争性抑制
⭐️ 概念：S和 I 可同时与酶结合，即S和 I 没有竞争作用。酶与 I 结合后，还可与S 结合；酶与S结合后，也可再结合 I ，但是三元的中间产物不能进一步分解为产物，所以酶活性降低。
★ 特点：① 非竞争性抑制剂与酶活性中心以外的基团结合 这类抑制作用不会因提高底物浓度而减弱。 ② 某些金属离子(Cu2+、Ag+、Hg+、Pb2+等) 对酶的抑制作用均属于这类抑制剂。;EDTA结合金属离子引起的抑制作用也属于非竞争性抑制。
● 举例：Leu是Arg酶的一种非竞争性抑制剂。
★ 动力学：
★ 加入非竞争性抑制剂后Km不变，而Vmax减小。
① k’m = Km，V ’mas 随 [I] 的↑而↓。 ②抑制分数与 [I] 成正比，与 [S] 无关。
（3）反竞争性抑制
⭐️ 概念：酶只有与S结合后才与 I 结合，从而导致酶活性下降。常见于多底物反应中，在单底物反应中少见。
● 举例：L-Phe、L-同型Arg等多种AA对碱性磷酸酶的作用就是反竞争性抑制剂； 草甘膦对芳香族氨基酸生物合成途径中5-烯醇丙 酮酸-3-磷酸合成酶(ESPS)的抑制作用等。
★ 动力学：
★ 加入反竞争性抑制剂使Km和Vmax均减小。
① Km与Vmas都↓，k’m < Km , V ’ mas < V mas ; ② 抑制分数既与 [I] 成正比也与 [S] 成正比。
（4）混合型抑制：介于竞争性抑制和非竞争性抑制之间，多见于双底物和多底物酶促反应。
总结
(三)可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别
1、物理方法：用透析、超滤或凝胶过无抑制剂不可逆抑制剂滤等物理方法区别。
2、动力学方法：① 在测定酶活力的系统中加入一定量的抑制剂，然后测定不同酶浓度的反应初速率。【E的浓度 ↑，把 I 消耗掉之后，与原来相同】
② 在测定酶活力的系统中加入不同浓度的抑制剂， 然后测定不同酶浓度的反应初速率。
（四）一些酶的可逆与不可逆抑制剂
1、不可逆性抑制剂
⭐️ 不可逆抑制作用：抑制剂与酶蛋白中的必需基团以共价键形式结合，引起酶的永久性失活,不能用透析或超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性。
(1)非专一性不可逆抑制剂：作用于酶的一类或几类基团(包括必需基团), 引起酶的失活。
① 有机磷化合物 → 与酶活性直接有关的Ser-OH牢固地结合，从而抑制某些蛋白酶或酯酶(DFP、敌百虫、敌敌畏、农药等)。
✔️这类化合物可抑制胆碱酯酶的活性 → 胆碱酯酶不能分解为乙酸+胆碱 → 神经系统过度兴奋，因此有机磷化合物又叫神经毒剂。
✔️可用解磷定或氯磷定解毒。
② 有机汞、有机砷化合物： → 与酶蛋白上的-SH作用，从而抑制含-SH 酶的活性。这类抑制作用可加入过量的巯基化合物(如半胱氨酸或还原型谷胱甘肽GSH)解除。
✔️有机砷化合物：路易斯毒气 → 与酶巯基结合 → 中毒；✔️解毒剂：BAL
③ 重金属盐： Ag+、Cu2+ 、Hg2+、Pb2+、Fe3+等在高浓度时能使大多数酶变性失活；低浓度时起抑制作用，加入金属螯合剂EDTA、半胱氨酸等可以解除。
④ 烷化剂：此类试剂含有一个活泼的卤素原子，如碘乙酸、2,4-二硝基氟苯等 → 使酶蛋白中的 –SH、-NH2、-OH、-COOH、咪唑基等发生烷基化 → 酶失活。
⑤ 氰化物、硫化物、CO：与金属离子形成稳定的络合物 → 酶活性受到抑制。
✔️氰化物与含铁卟啉的酶中的Fe2+结合 → 酶失活。
(2)专一性不可逆抑制剂：专一地作用某一酶的活性部位的必需基团导致酶失活。（分为Ks型和Kcat型两大类）
① Ks型不可逆抑制剂 / 亲和标记试剂
✔️根据底物化学结构设计的，与酶的底物结构类似（本身不是酶的底物），可以和相应的酶结合，同时还带有一个活泼的化学基团，能与酶活性中心基团反应进行化学修饰，从而抑制酶活性。因抑制是通过对酶的亲和力来对酶进行修饰标记的，又叫亲和标记试剂。
✔️ 由于这类抑制剂的活泼基团也可以修饰酶分子其它部位的同一基团，因此其专一性有一定的限度。//这取决于抑制剂与活性部位必需基团在反应前形成非共价络合物的解离常数以及非活性部位同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即Ks的比值，故这类抑制剂称为Ks型不可逆抑制剂。//
② Kcat型不可逆抑制剂 / 自杀性底物
✔️ 根据酶催化过程设计的，Kcat型抑制剂不但具有与天然底物类似的结构，而且本身也是酶的底物,还有一个潜伏的反应基团。当酶对这类抑制剂进行催化反应时，该潜伏反应基团被暴露或活化，又作用于酶活性中心的有关基团，使酶不可逆失活。即底物需经过酶催化之后，才能形成酶的不可逆抑制剂，因此，称之为“自杀性底物”。
💊举例：青霉素是糖肽转肽酶的Kcat型不可逆抑制剂。//青霉素本身是转肽酶的底物，其酰胺环上高反应活性肽键受 酶活性部位Ser-OH亲核攻击，形成共价键，使酶失活， 导致细菌细胞壁合成受到阻碍，从而起到抗菌作用。//
2、可逆抑制剂 【竞争性抑制剂】
✔️ 在可逆抑制剂中最重要的是竞争性抑制剂。大多数竞争性抑制剂与酶催化的天然代谢物在结构上十分相似， 能选择性地抑制病菌或癌细胞在代谢过程中的某些酶， 而具有抗癌和抗菌作用。这类抑制剂可称为抗代谢物或代谢类似物。
⭕️ 竞争性抑制剂举例
① 磺胺类药物：以对氨基苯磺酰胺为例说明磺胺药物的作用机制。
✔️磺胺药物与对氨基苯甲酸竞争 → 抑制二氢叶酸合成酶的活性 → 影响二氢叶酸的合成 → 细菌生长受限 → 治疗效果。
② 氨甲碟呤：其结构类似于二氢叶酸还原酶的底物 二氢叶酸，它对酶的结合力很强，抑制酶活性 → 影响抗核苷酸碱基的合成 → 治疗癌症。
💡启示： 利用竞争性抑制剂的原理来设计药物。
③ 过渡态类似物：是指底物和酶结合成中间复合物后被活化的过渡形式，由于能障小，与酶结合更加紧密。
💡若抑制剂的化学结构类似于过渡态底物，则其与酶的亲和力远大于底物，抑制效率更高❗️
四、温度对酶促反应的影响
1、最适温度 → 反应速度最大；
2、温度过低 → 抑制酶活性，一般不失活。
3、温度过高 →酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活力降低甚至丢失。
酶对温度的耐受力与其存在状态有关。
五、pH对酶促反应的影响
⭕️
1、最适pH → 酶有最大的催化活性。
✔️ 各种酶在一定条件下都有其特定的最适pH，因此最适pH 是酶的特性之一。✔️ 酶的最适pH不是一个常数， 受许多因素影响，随底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度的不同而改变，因此最适 pH只有在一定条件下才有意义
2、pH过高/过低 → 酶活性降低或失活。
pH影响酶活力的原因有以下几个方面：
（1)过酸或过碱可以使酶空间结构破坏,引起酶构象的改变。
(2)pH影响了底物的解离状态，或使底物不能和酶结合，或者结合后不能生 成产物; pH也影响酶分子活性部位上有关基团的解离，从而影响与底物的结 合或催化，使酶活性降低;也可能影响到中间络合物ES的解离状态，不利于 催化生成产物。
(3)pH影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响了酶活性部位的 构象，进而影响酶的活性。
⚠️ 由于酶活力受pH的影响很大，因此在酶的分离纯化 时要选择酶的稳定pH,通常 在某一pH缓冲液中进行。
六、激活剂对酶促反应的影响
1、激活剂：凡能提高酶活性的物质，都称为激活剂， 激活剂对酶的作用具有一定的选择性。如Mg2+是多数激酶合成酶的激活剂、Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。
🔺大部分是离子/简单化合物。激活剂按分子大小分为三类：(1)无机离子：金属离子(K+、Na+、Mg2+、); 阴离子(Cl- 、Br-)(2)小分子有机化合物：某些还原剂(如半胱氨酸、GSH 等)、乙二胺四乙酸(EDTA)(3)某些酶类:酶原激活过程中的酶类
竞交Y，非交X，反平行
第七章酶动力学
酶促反应动力学：是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。
一、化学动力学基础
（一）化学反应速率及其测定
⭐️反应速率：是以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。用瞬时速率表示反应速率。
（二）反应分子数与反应级数（实际应用上常采用反应级数）
· 在化学动力学中研究化学反应速率与反应物浓度的关系时，有两种分类方法：反应分子数及反应级数来分类。
反应分子数：反应中真正相互作用的分子的数目。
· 反应级数：化学反应服从那种分子反应速率方程式即为几级反应。如：（1）某反应总反应速率与浓度关系以单分子反应速率方程式表示 → 一级反应； （2）若用双分子反应速率方程式表示 → 二级反应；（3）把与反应速率与反应物浓度无关的反应 → 零级反应。
（三）各级反应的特征
⭐️半衰期：一半反应物转为产物所需的时间。记作t1/2。
二 、底物浓度对酶促反应速率的影响
（一）中间复合物学说
定义：① 酶催化某一化学反应时，酶首先和底物结合生成中间复合物(ES)，中间产物不稳定，极为活泼，易发生化学反应而生成产物(P)，并释放出酶。② 酶催化反应可以写成：S（底物）+ E（酶） ←→ ES（中间产物） ←→ P（反应产物）+E③ 表明反应速率取决于中间产物的浓度，当aq中的酶全部被饱和而转变成中间产物时，再增加底物浓度也无法改变稳定的最大反应速率。
· ES已被电子显微镜和X射线晶体结构分析直接观察到。
(二)酶促反应的动力学方程
1、米式方程 【单底物反应的动力学】
2、Briggs-Haldane修正的米氏方程【稳态模型】
● 稳态是反应系统中ES（中间产物）生成与分解速率相等时，ES浓度保持不变的这种状态。
★ 米式方程表示一个酶促反应的起始速度（v）与底物浓度（S）关系的速率方程。
★ Km值（米氏常数）：是当酶反应速率达到最大反应速率的一半时的底物浓度。因此, Km的单位为mol/L。
3、动力学参数的意义 【米式方程动力学——双曲线‼️】
（1）米式常数的意义
（1）Km是酶的一个特征性常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关,但受到底物、反应温度、pH、离子强度等的影响。【某一酶促反应，一定条件下有特定的Km值 → 鉴别酶】
（2）Km值可以判断酶的专一性和天然底物。【 Km值最小的底物 → 天然底物 】
（3）Km可表示酶和底物结合的亲和力大小。 【1/Km ↓，Km ↑，亲和力↓】
（4）若已知某个酶的Km值，可以计算在某一个底物浓度时，反应速率相当于最大反应速率Vmax的百分率。
（5）Km可以帮助推断某一反应的方向和途径、有助于寻找代谢限速步骤【Km ↑，V ↓，为限速反应】、可推断多酶体系中的优势途径【Km值 ↓ 的酶反应比较占优势】。
（2）Vmax和K2(Kcat)的意义
● Kcat：也称为转换数（TN），是酶最大催化活力的度量。定义为当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子将底物转换产物的分子数。【 Kcat越大，酶催化效率越高】
· 在一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一 个常数。同一种酶对不同底物的Vmax 也不同，pH、 温度和离子强度等因素也影响Vmax的数值。
（3）Kcat/Km（催化效率指数）
4、利用作图法测定Km和Vmax
· 基本原则:将米氏方程变化成相当于y=ax+b 的直线方程，再用作图法求出Km。
a.双倒数作图法：将米式方程两侧取倒。x轴和y轴上的截距是-1/Km和1/V0.
(三)多底物的酶促反应动力学
三、酶的抑制作用
概念
⭐️失活作用（inactivation）：凡使酶蛋白变性而引起的酶活力丧失的作用。
⭐️抑制作用 (inhibition)：由于酶必需基团化学性质改变，使酶的活性降低或丧失，但并不引起酶蛋白变性的作用。
🔺抑制剂(inhibitor)【 I 】：能够引起抑制作用的化合物。【抑制剂对酶的抑制作用是有选择性的，而变性剂则无】
（一) 抑制程度的表示方法
（二) 抑制作用的类型及动力学
● 酶的活性中心：酶与底物只能在一个区域结合，酶分子中能与底物结合并发生催化作用的局部空间结构称为酶的活性中心。它具有必需基团、结合基团和催化基团。
1、可逆的抑制作用
⭐️ 可逆抑制作用：抑制剂与酶蛋白以非共价键方式结合，引起酶活性降低或暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。
（1）竞争性抑制
⭐️概念：某些 I 的化学结构与 S 相似，因而能与底物竞争与酶活性中心结合。当 I 与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，酶促反应被抑制。
★ 特点：① 抑制程度取决于 S 与 I 的相对浓度； ② 抑制作用可通过增大底物浓度而解除。
● 举例：丙二酸和戊二酸与琥珀酸脱氢酶结合，但不能催化脱氢。
★ 动力学：
★ 加入竞争性抑制剂后，Km 变大，Vmax不变。
① Km变大，K’m > Km，且k’m随 [I] 的↑而↑； ② 抑制分数与 [I] 成正比，与 [S] 成反比。
（2）非竞争性抑制
⭐️ 概念：S和 I 可同时与酶结合，即S和 I 没有竞争作用。酶与 I 结合后，还可与S 结合；酶与S结合后，也可再结合 I ，但是三元的中间产物不能进一步分解为产物，所以酶活性降低。
★ 特点：① 非竞争性抑制剂与酶活性中心以外的基团结合 这类抑制作用不会因提高底物浓度而减弱。 ② 某些金属离子(Cu2+、Ag+、Hg+、Pb2+等) 对酶的抑制作用均属于这类抑制剂。;EDTA结合金属离子引起的抑制作用也属于非竞争性抑制。
● 举例：Leu是Arg酶的一种非竞争性抑制剂。
★ 动力学：
★ 加入非竞争性抑制剂后Km不变，而Vmax减小。
① k’m = Km，V ’mas 随 [I] 的↑而↓。 ②抑制分数与 [I] 成正比，与 [S] 无关。
（3）反竞争性抑制
⭐️ 概念：酶只有与S结合后才与 I 结合，从而导致酶活性下降。常见于多底物反应中，在单底物反应中少见。
● 举例：L-Phe、L-同型Arg等多种AA对碱性磷酸酶的作用就是反竞争性抑制剂； 草甘膦对芳香族氨基酸生物合成途径中5-烯醇丙 酮酸-3-磷酸合成酶(ESPS)的抑制作用等。
★ 动力学：
★ 加入反竞争性抑制剂使Km和Vmax均减小。
① Km与Vmas都↓，k’m < Km , V ’ mas < V mas ; ② 抑制分数既与 [I] 成正比也与 [S] 成正比。
（4）混合型抑制：介于竞争性抑制和非竞争性抑制之间，多见于双底物和多底物酶促反应。
总结
(三)可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别
1、物理方法：用透析、超滤或凝胶过无抑制剂不可逆抑制剂滤等物理方法区别。
2、动力学方法：① 在测定酶活力的系统中加入一定量的抑制剂，然后测定不同酶浓度的反应初速率。【E的浓度 ↑，把 I 消耗掉之后，与原来相同】
② 在测定酶活力的系统中加入不同浓度的抑制剂， 然后测定不同酶浓度的反应初速率。
（四）一些酶的可逆与不可逆抑制剂
1、不可逆性抑制剂
⭐️ 不可逆抑制作用：抑制剂与酶蛋白中的必需基团以共价键形式结合，引起酶的永久性失活,不能用透析或超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性。
(1)非专一性不可逆抑制剂：作用于酶的一类或几类基团(包括必需基团), 引起酶的失活。
① 有机磷化合物 → 与酶活性直接有关的Ser-OH牢固地结合，从而抑制某些蛋白酶或酯酶(DFP、敌百虫、敌敌畏、农药等)。
✔️这类化合物可抑制胆碱酯酶的活性 → 胆碱酯酶不能分解为乙酸+胆碱 → 神经系统过度兴奋，因此有机磷化合物又叫神经毒剂。
✔️可用解磷定或氯磷定解毒。
② 有机汞、有机砷化合物： → 与酶蛋白上的-SH作用，从而抑制含-SH 酶的活性。这类抑制作用可加入过量的巯基化合物(如半胱氨酸或还原型谷胱甘肽GSH)解除。
✔️有机砷化合物：路易斯毒气 → 与酶巯基结合 → 中毒；✔️解毒剂：BAL
③ 重金属盐： Ag+、Cu2+ 、Hg2+、Pb2+、Fe3+等在高浓度时能使大多数酶变性失活；低浓度时起抑制作用，加入金属螯合剂EDTA、半胱氨酸等可以解除。
④ 烷化剂：此类试剂含有一个活泼的卤素原子，如碘乙酸、2,4-二硝基氟苯等 → 使酶蛋白中的 –SH、-NH2、-OH、-COOH、咪唑基等发生烷基化 → 酶失活。
⑤ 氰化物、硫化物、CO：与金属离子形成稳定的络合物 → 酶活性受到抑制。
✔️氰化物与含铁卟啉的酶中的Fe2+结合 → 酶失活。
(2)专一性不可逆抑制剂：专一地作用某一酶的活性部位的必需基团导致酶失活。（分为Ks型和Kcat型两大类）
① Ks型不可逆抑制剂 / 亲和标记试剂
✔️根据底物化学结构设计的，与酶的底物结构类似（本身不是酶的底物），可以和相应的酶结合，同时还带有一个活泼的化学基团，能与酶活性中心基团反应进行化学修饰，从而抑制酶活性。因抑制是通过对酶的亲和力来对酶进行修饰标记的，又叫亲和标记试剂。
✔️ 由于这类抑制剂的活泼基团也可以修饰酶分子其它部位的同一基团，因此其专一性有一定的限度。//这取决于抑制剂与活性部位必需基团在反应前形成非共价络合物的解离常数以及非活性部位同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即Ks的比值，故这类抑制剂称为Ks型不可逆抑制剂。//
② Kcat型不可逆抑制剂 / 自杀性底物
✔️ 根据酶催化过程设计的，Kcat型抑制剂不但具有与天然底物类似的结构，而且本身也是酶的底物,还有一个潜伏的反应基团。当酶对这类抑制剂进行催化反应时，该潜伏反应基团被暴露或活化，又作用于酶活性中心的有关基团，使酶不可逆失活。即底物需经过酶催化之后，才能形成酶的不可逆抑制剂，因此，称之为“自杀性底物”。
💊举例：青霉素是糖肽转肽酶的Kcat型不可逆抑制剂。//青霉素本身是转肽酶的底物，其酰胺环上高反应活性肽键受 酶活性部位Ser-OH亲核攻击，形成共价键，使酶失活， 导致细菌细胞壁合成受到阻碍，从而起到抗菌作用。//
2、可逆抑制剂 【竞争性抑制剂】
✔️ 在可逆抑制剂中最重要的是竞争性抑制剂。大多数竞争性抑制剂与酶催化的天然代谢物在结构上十分相似， 能选择性地抑制病菌或癌细胞在代谢过程中的某些酶， 而具有抗癌和抗菌作用。这类抑制剂可称为抗代谢物或代谢类似物。
⭕️ 竞争性抑制剂举例
① 磺胺类药物：以对氨基苯磺酰胺为例说明磺胺药物的作用机制。
✔️磺胺药物与对氨基苯甲酸竞争 → 抑制二氢叶酸合成酶的活性 → 影响二氢叶酸的合成 → 细菌生长受限 → 治疗效果。
② 氨甲碟呤：其结构类似于二氢叶酸还原酶的底物 二氢叶酸，它对酶的结合力很强，抑制酶活性 → 影响抗核苷酸碱基的合成 → 治疗癌症。
💡启示： 利用竞争性抑制剂的原理来设计药物。
③ 过渡态类似物：是指底物和酶结合成中间复合物后被活化的过渡形式，由于能障小，与酶结合更加紧密。
💡若抑制剂的化学结构类似于过渡态底物，则其与酶的亲和力远大于底物，抑制效率更高❗️
四、温度对酶促反应的影响
1、最适温度 → 反应速度最大；
2、温度过低 → 抑制酶活性，一般不失活。
3、温度过高 →酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活力降低甚至丢失。
酶对温度的耐受力与其存在状态有关。
五、pH对酶促反应的影响
⭕️
1、最适pH → 酶有最大的催化活性。
✔️ 各种酶在一定条件下都有其特定的最适pH，因此最适pH 是酶的特性之一。✔️ 酶的最适pH不是一个常数， 受许多因素影响，随底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度的不同而改变，因此最适 pH只有在一定条件下才有意义
2、pH过高/过低 → 酶活性降低或失活。
pH影响酶活力的原因有以下几个方面：
（1)过酸或过碱可以使酶空间结构破坏,引起酶构象的改变。
(2)pH影响了底物的解离状态，或使底物不能和酶结合，或者结合后不能生 成产物; pH也影响酶分子活性部位上有关基团的解离，从而影响与底物的结 合或催化，使酶活性降低;也可能影响到中间络合物ES的解离状态，不利于 催化生成产物。
(3)pH影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响了酶活性部位的 构象，进而影响酶的活性。
⚠️ 由于酶活力受pH的影响很大，因此在酶的分离纯化 时要选择酶的稳定pH,通常 在某一pH缓冲液中进行。
六、激活剂对酶促反应的影响
1、激活剂：凡能提高酶活性的物质，都称为激活剂， 激活剂对酶的作用具有一定的选择性。如Mg2+是多数激酶合成酶的激活剂、Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。
🔺大部分是离子/简单化合物。激活剂按分子大小分为三类：(1)无机离子：金属离子(K+、Na+、Mg2+、); 阴离子(Cl- 、Br-)(2)小分子有机化合物：某些还原剂(如半胱氨酸、GSH 等)、乙二胺四乙酸(EDTA)(3)某些酶类:酶原激活过程中的酶类
第七章酶动力学
酶促反应动力学：是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。
一、化学动力学基础
（一）化学反应速率及其测定
⭐️反应速率：是以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。用瞬时速率表示反应速率。
（二）反应分子数与反应级数（实际应用上常采用反应级数）
· 在化学动力学中研究化学反应速率与反应物浓度的关系时，有两种分类方法：反应分子数及反应级数来分类。
反应分子数：反应中真正相互作用的分子的数目。
· 反应级数：化学反应服从那种分子反应速率方程式即为几级反应。如：（1）某反应总反应速率与浓度关系以单分子反应速率方程式表示 → 一级反应； （2）若用双分子反应速率方程式表示 → 二级反应；（3）把与反应速率与反应物浓度无关的反应 → 零级反应。
（三）各级反应的特征
⭐️半衰期：一半反应物转为产物所需的时间。记作t1/2。
二 、底物浓度对酶促反应速率的影响
（一）中间复合物学说
定义：① 酶催化某一化学反应时，酶首先和底物结合生成中间复合物(ES)，中间产物不稳定，极为活泼，易发生化学反应而生成产物(P)，并释放出酶。② 酶催化反应可以写成：S（底物）+ E（酶） ←→ ES（中间产物） ←→ P（反应产物）+E③ 表明反应速率取决于中间产物的浓度，当aq中的酶全部被饱和而转变成中间产物时，再增加底物浓度也无法改变稳定的最大反应速率。
· ES已被电子显微镜和X射线晶体结构分析直接观察到。
(二)酶促反应的动力学方程
1、米式方程 【单底物反应的动力学】
2、Briggs-Haldane修正的米氏方程【稳态模型】
● 稳态是反应系统中ES（中间产物）生成与分解速率相等时，ES浓度保持不变的这种状态。
★ 米式方程表示一个酶促反应的起始速度（v）与底物浓度（S）关系的速率方程。
★ Km值（米氏常数）：是当酶反应速率达到最大反应速率的一半时的底物浓度。因此, Km的单位为mol/L。
3、动力学参数的意义 【米式方程动力学——双曲线‼️】
（1）米式常数的意义
（1）Km是酶的一个特征性常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关,但受到底物、反应温度、pH、离子强度等的影响。【某一酶促反应，一定条件下有特定的Km值 → 鉴别酶】
（2）Km值可以判断酶的专一性和天然底物。【 Km值最小的底物 → 天然底物 】
（3）Km可表示酶和底物结合的亲和力大小。 【1/Km ↓，Km ↑，亲和力↓】
（4）若已知某个酶的Km值，可以计算在某一个底物浓度时，反应速率相当于最大反应速率Vmax的百分率。
（5）Km可以帮助推断某一反应的方向和途径、有助于寻找代谢限速步骤【Km ↑，V ↓，为限速反应】、可推断多酶体系中的优势途径【Km值 ↓ 的酶反应比较占优势】。
（2）Vmax和K2(Kcat)的意义
● Kcat：也称为转换数（TN），是酶最大催化活力的度量。定义为当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子将底物转换产物的分子数。【 Kcat越大，酶催化效率越高】
· 在一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一 个常数。同一种酶对不同底物的Vmax 也不同，pH、 温度和离子强度等因素也影响Vmax的数值。
（3）Kcat/Km（催化效率指数）
4、利用作图法测定Km和Vmax
· 基本原则:将米氏方程变化成相当于y=ax+b 的直线方程，再用作图法求出Km。
a.双倒数作图法：将米式方程两侧取倒。x轴和y轴上的截距是-1/Km和1/V0.
(三)多底物的酶促反应动力学
第七章酶动力学
三、酶的抑制作用
概念
⭐️失活作用（inactivation）：凡使酶蛋白变性而引起的酶活力丧失的作用。
⭐️抑制作用 (inhibition)：由于酶必需基团化学性质改变，使酶的活性降低或丧失，但并不引起酶蛋白变性的作用。
🔺抑制剂(inhibitor)【 I 】：能够引起抑制作用的化合物。【抑制剂对酶的抑制作用是有选择性的，而变性剂则无】
（一) 抑制程度的表示方法
（二) 抑制作用的类型及动力学
● 酶的活性中心：酶与底物只能在一个区域结合，酶分子中能与底物结合并发生催化作用的局部空间结构称为酶的活性中心。它具有必需基团、结合基团和催化基团。
1、可逆的抑制作用
⭐️ 可逆抑制作用：抑制剂与酶蛋白以非共价键方式结合，引起酶活性降低或暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。
（1）竞争性抑制
⭐️概念：某些 I 的化学结构与 S 相似，因而能与底物竞争与酶活性中心结合。当 I 与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，酶促反应被抑制。
★ 特点：① 抑制程度取决于 S 与 I 的相对浓度； ② 抑制作用可通过增大底物浓度而解除。
● 举例：丙二酸和戊二酸与琥珀酸脱氢酶结合，但不能催化脱氢。
★ 动力学：
★ 加入竞争性抑制剂后，Km 变大，Vmax不变。
① Km变大，K’m > Km，且k’m随 [I] 的↑而↑； ② 抑制分数与 [I] 成正比，与 [S] 成反比。
（2）非竞争性抑制
⭐️ 概念：S和 I 可同时与酶结合，即S和 I 没有竞争作用。酶与 I 结合后，还可与S 结合；酶与S结合后，也可再结合 I ，但是三元的中间产物不能进一步分解为产物，所以酶活性降低。
★ 特点：① 非竞争性抑制剂与酶活性中心以外的基团结合 这类抑制作用不会因提高底物浓度而减弱。 ② 某些金属离子(Cu2+、Ag+、Hg+、Pb2+等) 对酶的抑制作用均属于这类抑制剂。;EDTA结合金属离子引起的抑制作用也属于非竞争性抑制。
● 举例：Leu是Arg酶的一种非竞争性抑制剂。
★ 动力学：
★ 加入非竞争性抑制剂后Km不变，而Vmax减小。
① k’m = Km，V ’mas 随 [I] 的↑而↓。 ②抑制分数与 [I] 成正比，与 [S] 无关。
（3）反竞争性抑制
⭐️ 概念：酶只有与S结合后才与 I 结合，从而导致酶活性下降。常见于多底物反应中，在单底物反应中少见。
● 举例：L-Phe、L-同型Arg等多种AA对碱性磷酸酶的作用就是反竞争性抑制剂； 草甘膦对芳香族氨基酸生物合成途径中5-烯醇丙 酮酸-3-磷酸合成酶(ESPS)的抑制作用等。
★ 动力学：
★ 加入反竞争性抑制剂使Km和Vmax均减小。
① Km与Vmas都↓，k’m < Km , V ’ mas < V mas ; ② 抑制分数既与 [I] 成正比也与 [S] 成正比。
（4）混合型抑制：介于竞争性抑制和非竞争性抑制之间，多见于双底物和多底物酶促反应。
总结
第七章酶动力学
(三)可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别
1、物理方法：用透析、超滤或凝胶过无抑制剂不可逆抑制剂滤等物理方法区别。
2、动力学方法：① 在测定酶活力的系统中加入一定量的抑制剂，然后测定不同酶浓度的反应初速率。【E的浓度 ↑，把 I 消耗掉之后，与原来相同】
② 在测定酶活力的系统中加入不同浓度的抑制剂， 然后测定不同酶浓度的反应初速率。
（四）一些酶的可逆与不可逆抑制剂
1、不可逆性抑制剂
⭐️ 不可逆抑制作用：抑制剂与酶蛋白中的必需基团以共价键形式结合，引起酶的永久性失活,不能用透析或超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性。
(1)非专一性不可逆抑制剂：作用于酶的一类或几类基团(包括必需基团), 引起酶的失活。
① 有机磷化合物 → 与酶活性直接有关的Ser-OH牢固地结合，从而抑制某些蛋白酶或酯酶(DFP、敌百虫、敌敌畏、农药等)。
✔️这类化合物可抑制胆碱酯酶的活性 → 胆碱酯酶不能分解为乙酸+胆碱 → 神经系统过度兴奋，因此有机磷化合物又叫神经毒剂。
✔️可用解磷定或氯磷定解毒。
② 有机汞、有机砷化合物： → 与酶蛋白上的-SH作用，从而抑制含-SH 酶的活性。这类抑制作用可加入过量的巯基化合物(如半胱氨酸或还原型谷胱甘肽GSH)解除。
✔️有机砷化合物：路易斯毒气 → 与酶巯基结合 → 中毒；✔️解毒剂：BAL
③ 重金属盐： Ag+、Cu2+ 、Hg2+、Pb2+、Fe3+等在高浓度时能使大多数酶变性失活；低浓度时起抑制作用，加入金属螯合剂EDTA、半胱氨酸等可以解除。
④ 烷化剂：此类试剂含有一个活泼的卤素原子，如碘乙酸、2,4-二硝基氟苯等 → 使酶蛋白中的 –SH、-NH2、-OH、-COOH、咪唑基等发生烷基化 → 酶失活。
⑤ 氰化物、硫化物、CO：与金属离子形成稳定的络合物 → 酶活性受到抑制。
✔️氰化物与含铁卟啉的酶中的Fe2+结合 → 酶失活。
(2)专一性不可逆抑制剂：专一地作用某一酶的活性部位的必需基团导致酶失活。（分为Ks型和Kcat型两大类）
① Ks型不可逆抑制剂 / 亲和标记试剂
✔️根据底物化学结构设计的，与酶的底物结构类似（本身不是酶的底物），可以和相应的酶结合，同时还带有一个活泼的化学基团，能与酶活性中心基团反应进行化学修饰，从而抑制酶活性。因抑制是通过对酶的亲和力来对酶进行修饰标记的，又叫亲和标记试剂。
✔️ 由于这类抑制剂的活泼基团也可以修饰酶分子其它部位的同一基团，因此其专一性有一定的限度。//这取决于抑制剂与活性部位必需基团在反应前形成非共价络合物的解离常数以及非活性部位同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即Ks的比值，故这类抑制剂称为Ks型不可逆抑制剂。//
② Kcat型不可逆抑制剂 / 自杀性底物
✔️ 根据酶催化过程设计的，Kcat型抑制剂不但具有与天然底物类似的结构，而且本身也是酶的底物,还有一个潜伏的反应基团。当酶对这类抑制剂进行催化反应时，该潜伏反应基团被暴露或活化，又作用于酶活性中心的有关基团，使酶不可逆失活。即底物需经过酶催化之后，才能形成酶的不可逆抑制剂，因此，称之为“自杀性底物”。
💊举例：青霉素是糖肽转肽酶的Kcat型不可逆抑制剂。//青霉素本身是转肽酶的底物，其酰胺环上高反应活性肽键受 酶活性部位Ser-OH亲核攻击，形成共价键，使酶失活， 导致细菌细胞壁合成受到阻碍，从而起到抗菌作用。//
2、可逆抑制剂 【竞争性抑制剂】
✔️ 在可逆抑制剂中最重要的是竞争性抑制剂。大多数竞争性抑制剂与酶催化的天然代谢物在结构上十分相似， 能选择性地抑制病菌或癌细胞在代谢过程中的某些酶， 而具有抗癌和抗菌作用。这类抑制剂可称为抗代谢物或代谢类似物。
⭕️ 竞争性抑制剂举例
① 磺胺类药物：以对氨基苯磺酰胺为例说明磺胺药物的作用机制。
✔️磺胺药物与对氨基苯甲酸竞争 → 抑制二氢叶酸合成酶的活性 → 影响二氢叶酸的合成 → 细菌生长受限 → 治疗效果。
② 氨甲碟呤：其结构类似于二氢叶酸还原酶的底物 二氢叶酸，它对酶的结合力很强，抑制酶活性 → 影响抗核苷酸碱基的合成 → 治疗癌症。
💡启示： 利用竞争性抑制剂的原理来设计药物。
③ 过渡态类似物：是指底物和酶结合成中间复合物后被活化的过渡形式，由于能障小，与酶结合更加紧密。
💡若抑制剂的化学结构类似于过渡态底物，则其与酶的亲和力远大于底物，抑制效率更高❗️
四、温度对酶促反应的影响
1、最适温度 → 反应速度最大；
2、温度过低 → 抑制酶活性，一般不失活。
3、温度过高 →酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活力降低甚至丢失。
酶对温度的耐受力与其存在状态有关。
五、pH对酶促反应的影响
⭕️
1、最适pH → 酶有最大的催化活性。
✔️ 各种酶在一定条件下都有其特定的最适pH，因此最适pH 是酶的特性之一。✔️ 酶的最适pH不是一个常数， 受许多因素影响，随底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度的不同而改变，因此最适 pH只有在一定条件下才有意义
2、pH过高/过低 → 酶活性降低或失活。
pH影响酶活力的原因有以下几个方面：
（1)过酸或过碱可以使酶空间结构破坏,引起酶构象的改变。
(2)pH影响了底物的解离状态，或使底物不能和酶结合，或者结合后不能生 成产物; pH也影响酶分子活性部位上有关基团的解离，从而影响与底物的结 合或催化，使酶活性降低;也可能影响到中间络合物ES的解离状态，不利于 催化生成产物。
(3)pH影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响了酶活性部位的 构象，进而影响酶的活性。
⚠️ 由于酶活力受pH的影响很大，因此在酶的分离纯化 时要选择酶的稳定pH,通常 在某一pH缓冲液中进行。
六、激活剂对酶促反应的影响
1、激活剂：凡能提高酶活性的物质，都称为激活剂， 激活剂对酶的作用具有一定的选择性。如Mg2+是多数激酶合成酶的激活剂、Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。
🔺大部分是离子/简单化合物。激活剂按分子大小分为三类：(1)无机离子：金属离子(K+、Na+、Mg2+、); 阴离子(Cl- 、Br-)(2)小分子有机化合物：某些还原剂(如半胱氨酸、GSH 等)、乙二胺四乙酸(EDTA)(3)某些酶类:酶原激活过程中的酶类