第三章 临床标本处理与分离纯化技术

第三章 临床标本处理与分离纯化技术知识梳理，包括临床标本的处理、生物样本分离纯化与质量鉴定等等。

临床标本处理与分离纯化技术

• 引言
  • 临床标本的收集、运送和保存，以及核酸、蛋白质的分离纯化
    • 对检验结果准确性有决定性的影响
    • 关键步骤
• 临床标本的处理
  • 规范操作程序，保证测定准确可靠
  • 一般原则
    • 标本采集的时间和注意事项
    • 标本的类型和数量
    • 标本采集部位的准备
    • 标本的运送
      • 快，2-8℃低温
    • 标本的保存
      • DNA：2-8℃，1周
      • RNA和蛋白质：-20℃，-70℃以下或液氮
    • 标本处理中的生物安全问题
      • 依据生物安全制度和操作程序
  • 常见标本的处理方法
    • 血液标本
      • 全血标本
        • 用EDTA、枸橼酸盐作为抗凝剂，不可用肝素（对TaqDNA聚合酶有强抑制作用）
      • 血清（浆）标本
      • 外周血单个核细胞
        • Ficoll分离法
    • 棉拭子
      • 呼吸道和消化道处标本采集
      • 核酸提取：置于等渗溶液中→震荡洗涤→静置→沉淀物
    • 体液标本
      • 浆膜腔积液、脑脊液、尿液、关节积液
      • 核酸提取：离心收集沉淀，弃去上清液
    • 痰液标本
      • 结核菌（NaOH或变性剂液化）、肺炎支原体（悬浮生理水）
      • 初步处理→离心→核酸提取
    • 组织标本
      • 新鲜切片→液氮→匀浆化→蛋白酶K消化→核酸提取
      • 石蜡切片→二甲苯脱蜡→浓度逐渐降低乙醇中浸泡复水、蛋白酶K消化→核酸提取
    • 细胞标本
      • 贴壁细胞：胰酶消化→离心→PBS（磷酸盐缓冲溶液）重悬→离心→核酸提取
• 生物样本分离纯化与质量鉴定
  • 生物样本分离纯化策略
    • 制备细胞及破碎细胞
    • 消化蛋白质，去除与核酸结合的蛋白质、多糖及脂类等生物大分子
    • 去除其他不需要的核酸分子
    • 沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质
  • DNA的分离纯化
    • 三个条件
      • 应保证不含对酶活性有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子
      • 最大程度上避免蛋白质、多糖和脂类的污染
      • 排除RNA分子的污染与干扰
    • 基因组DNA的纯化
      • 酚-氯仿抽提法
    • 吸附柱法提取DNA
      • 裂解→吸附→洗脱
    • 质粒DNA的分离纯化
      • 碱变性质粒DNA抽提法：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异来达到分离质粒DNA的目的
    • 线粒体DNA的分离纯化
      • 经典DNA提取方法
    • 血浆中游离DNA/循环DNA的分离纯化
      • 循环血中游离于细胞外已部分降解的机体内源性DNA
      • 应用于：产前诊断、肿瘤诊断、治疗检测
  • RNA的分离纯化
    • 易降解，较DNA更严格（大量RNase，较耐高温，不易失活，降解RNA）
    • 总RNA的制备
      • Trizol试剂（苯酚和异硫氰酸胍混合的溶液）能迅速破碎细胞并抑制核酸酶，保持RNA完整性，但对人体有害（需做好防护）
      • 氯仿：有助于水相与有机相分离和除去RNA溶液中的酚
    • mRNA的制备
      • mRNA在其3‘端均有-poly（A）尾（选择性标志），可以用聚寡（dT）-纤维素柱层析法从大量的细胞RNA中分离mRNA（结合-洗脱步骤）
    • 循环miRNA的制备
    • 长链非编码RNA的制备
  • 自动化核酸提取系统
    • 高通量、节省人工成本、缩短工作时间
    • 方法
      • 硅胶膜吸附法
        • 核酸吸附到硅胶膜，冲洗去除杂质，洗脱获得样品
      • 硅胶磁珠分离法
        • 带磁性的磁珠吸附核酸分子
  • 蛋白质的分离纯化
    • 蛋白质的性质与原则
      • 利用差异
        • 分子大小、形状、电荷、疏水性及溶解度等
      • 纯化原则
        • 冰上、低温、合适 pH 缓冲液溶解、蛋白酶抑制剂（防止降解）
      • 避免反复冻融和剧烈搅拌
    • 常用方法
      • 根据分子大小
        • 透析
          • 小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子 与生物大分子分开的一种分离纯化技术。
        • 超滤
          • 一定压力下＋一定孔径的薄膜。
        • 离心分离
          • 利用物质沉降系数、质量、形状及密度的不同。
        • 凝胶过滤层析
          • 分子筛层析，根据蛋白质的大小和形状，使蛋白质组分按照不同分子大小分离。
      • 根据溶解度不同
        • 等电点沉淀
          • 等电点时蛋白质的净电荷为零，溶解度最低。
        • 蛋白质的盐溶与盐析
          • 中性盐对球状蛋白质的溶解度有明显影响。
      • 根据表面电荷不同（不同PH环境）
        • 电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
          • 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）
            • 在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
          • SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）
            • 仅根据蛋白质的分子量的不同就可以分开蛋白质。
        • 离子交换层析（IEG）
          • 以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法
      • 根据配体特异性亲和力
        • 分子的特定结构部位能够同其他分子特异性的识别并结合，且具有特异性、可逆性
          • 抗原-抗体
          • 酶-底物
          • 受体-配体
        • 蛋白质亲和层析
          • 利用共价连接有特异配体的层析介质，分离蛋白混合物中能特异结合配体的目的蛋白的技术
    • 膜蛋白的分离与纯化
      • 膜蛋白
        • 能够结合或整合到细胞或细胞器膜上的蛋白质的总称
          • 外在膜蛋白
            • 水溶性蛋白，通过改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏
          • 内在膜蛋白
            • 水溶性不好，需要用去垢剂使膜裂解后オ可释放出来。基本方法是梯度离心得到含有膜蛋白的粗组分，用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。
  • 核酸和蛋白质的鉴定
    • 核酸的测定
      • 核酸含量的测定
        • A260=1.0即
          • 50μg/ml双链DNA
          • 40μg/ml单链RNA
      • 核酸的纯度测定
        • 紫外分光光度法
          • A230（盐和小分子）
          • A260（核酸）
          • A280（蛋白质）
          • 通过A260/A280的比值来判定核算纯度及有无蛋白质的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不纯
            • DNA纯品
              • A260/A280=1.8左右
            • RNA纯品
              • A260/A280=1.8-2.0
            • DNA纯品
              • A260/A280=0.4-0.5脂键，超过则有残余盐分
        • 荧光光度法
          • 由EB等荧光染料所示踪的核酸电泳可判定核酸的纯度
          • 溴化乙铵（EB）
            • 是一种高灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA
            • 可嵌入碱基分子中，2.5一个，是强诱变剂，具有高致癌性
      • 核酸的完整性检测
        • 需加入上样缓冲液进行琼脂糖凝胶电泳
        • 以 EB 为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性，基因组 DNA 如果发生降解，电泳图呈拖尾状
    • 蛋白质的鉴定
      • 浓度鉴定
        • Folin-酚试剂法
        • 紫外线（UV）吸收法
          • 简单
        • 考马斯亮蓝绿显色法
      • 纯度鉴定
        • HPLC（高效液相色谱）
        • SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）