6微生物检验

这是一篇关于食品微生物-6微生物检验思维导图，包含微生物数量测定、样品的采集与处理、 生物分析及相关技术等。

食品中微生物及其 代谢产物的检测

微生物数量测定

标准平板计数法 SPC

实验流程

取样

稀释

十倍稀释

接种：2-3个连续稀释度，平行对照

倾注法

涂布法

可检测热敏性菌体

更适合严格好氧菌

菌落形态明显，观察群体特征

不会与食品颗粒混淆

菌落易重叠混杂

培养

培养基，条件

倒置培养：培养基失重小于15%

防止水滴滴落

防生长杂菌

菌落计数

选取菌落数合适的平板，细菌30～300CFU，霉菌/酵母菌10～150CFU

方法：肉眼观察，菌落计数器

识别菌落：菌落太小或与样品颗粒相似—染色还原法，TTC（红四氮唑，显色培养基），细菌特性

计算

报告，两位有效数字，空白对照有菌落检测结果无效

意义

判定微生物污染程度及卫生质量

预测食品存放期

反映新鲜度

监测生长繁殖动态

生物制品检验：污染、益生菌

其他方法

水化干膜法-培养基

原理：预制培养基系统，可再生水化干膜，培养基、冷水可溶性凝胶、指示剂、印有方格

操作步骤：稀释，接种，培养，计数，报告

优点

生产效率高

误差小

国际化：官方机构的批准

快速：6-14小时可估计24小时准确结果 3-5天确认霉菌和酵母菌数

鉴别培养基

旋转接种法

依据阿基米德螺旋为接种轨迹，以递减的比率接种样品

自动螺旋仪接种，计数系统

计数方法：长出菌落中间多，四周少，计算单位面积菌落数

优点

测定结果与SPC相关性高

缺点

最近似数测定法MPN

利用待测微生物的特殊生理功能，用选择性培养基（减少干扰），判断微生物的存在和丰度

检测具有营养与代谢特性的微生物如大肠菌群

操作简单

可测定在微生物群落中不占优势的微生物

大肠菌群

肠道菌，与粪便污染有关

在一定培养条件下发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧的阴性无芽胞杆菌

初发酵：LST，产气者复发酵BGLB

检测大肠杆菌的意义

粪便污染指示菌，评价食品卫生质量

评价肠道致病菌污染的可能，如沙门，志贺

作为指示菌的优点

来源多，数量多，检出率高

外界存活时间基本一致

对杀菌剂的抵抗力基本一致

操作简单，无需复杂设备

灵敏度高

染色还原计数法（估算法）

原理：活细胞内含有还原酶，可把特定的燃料从一种颜色还原为另一种颜色。

常用试剂

亚甲基蓝

蓝色变白色

刃天青

暗蓝色变成粉红色，白色

四氮唑

无色变红色

还原时间与微生物浓度成反比，常用于牛乳卫生，精子活性

优点

简便，快捷和经济

缺点

微生物还原能力不同，估算困难，不适合含还原酶的食品

显微直接计数法DMC

计数板直接计数

彼得罗夫霍泽细胞计数板（一般细菌），血球计数板（酵母/霉菌孢子）

计一定容积中微生物数量，但不能区分杂菌

优点

快捷，方便，分析细胞形态，载玻片易保存

缺点

仅适于含菌量多的样品，准确性差，易疲劳

其他方法

棉拭子涂抹法，采样方法

表面微生物的检测

应用于食品，器械表面，公共场所

膜过滤法，样品浓缩

含菌量很少的样品，富集菌体，提高检出率

不受样品体积限制

检测方法：SPC，显微计数，与染色方法结合

物理，化学，分子和免疫方法

物理

阻抗测定法

阻抗

在具有电阻，电感和电容的生物材料中对测定电流起阻碍作用的叫阻抗

原理：微生物使培养基电特性改变，电惰性底物分解成电活性分子，离子，培养基的电导性增大，阻抗降低

电导率随时间的变化

检测时间：从培养到阻抗值发生急剧变化的时间，与原始菌数成反比

推演出微生物的原始菌量

微生物的阻抗曲线各不相同

微生物鉴定

直接阻抗法

培养基装入特制的测量管，接种微生物后在培养基中插入电极，直接测量培养基的电特性变化

关键因素，培养基

被测菌➕产生可监测的阻抗变化

间接阻抗法

微生物代谢产生如二氧化碳等，来反映微生物的代谢活性

二氧化碳进入测试管与氢氧化钾反映产生碳酸盐，其导电性降低，记录导电性变化

优点

无需优化培养基（可以没有电反应）

可以测量含高盐的培养基

可测微生物产生非常小或根本不产生可测的导电性变化，如酵母

可测食品本身干扰阻抗测量甚至损害电极

微量量热法

化学

ATP的测定

活细胞的能量来源，细胞死亡两小时后消失

细胞ATP恒定，其总量与细菌数量成正比，可推算

原核生物指数增长细胞的ATP含量通常2-6nmol/mg干重

同种属细胞准确测量ATP

常用方法 —荧光酶系统测定ATP

ATP参与荧光素-荧光素酶系统，使荧光素发光，发光量与ATP成正比

以发光强度推算出细胞数

可自动测定，快速检测，结果与SPC法一致，省时

应用

发酵液的菌数测定

尿样检测

表面微生物测定

辐射测量法

原理：细菌代谢碳水化合物时产生二氧化碳，把微量元素标记到葡萄糖或其他糖类分子中，检测释放的二氧化碳

放射量与菌数成正比

检测时间与微生物数量成反比

放射能计数器

应用

吹气查胃病

食品微生物检测

食品微生物的指纹识别和鉴定

指纹：特征性的化学组分，结构，性能差异及特异性代谢产物

特征性的图谱：可识别，唯一

核酸识别

16srRNA碱基序列

rRNA占RNA总量的80%

许多区段高度保守

生物进化计时器

系统发育图谱

PCR

聚合酶链式反应，无细胞克隆，即细胞外对特定的DNA片段进行扩增的分子生物学技术

检测病原菌：特异性片段，保守性

原理：在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性，退火，延伸等步骤，体外复制出与模板DNA互补的子链DNA的过程

反应组分

模板DNA：目标基因-微生物特有的一段基因

引物一对：复制的起点和终点，复制的特异性

dNTP:A、T、G、C

DNA聚合酶

反应缓冲液，镁盐溶液

优点

体外扩增特异核酸片段

快速，灵敏，特异

自动微生物分析系统

全自动微生物分析

原理：仪器把对细菌鉴定必须的生化反应培养基固定到卡片上，培养后仪器对显示反应进行判断，利用数值法进行判定

革兰氏阴性菌卡，革兰氏阳性菌卡，酵母菌卡

API细菌鉴定系统

免疫学方法

抗原（Ag）：能诱导免疫系统产生免疫应答，并与其产生的抗体或效应细胞在体内或体外发生特异性反应的物质

抗原决定簇：抗原表面的活性基团

抗原特性

抗原性：免疫原性和反应原性

异源性：蛋白质，糖，核酸（化学组成），5-10ku免疫效果不佳（分子量）

抗体（Ab）：抗原进入机体刺激B细胞合成并分泌的一类能与抗原发生特异性反应的活性物质，主要存在于血清内

抗原抗体的检测方法：检测菌体或毒素

凝集反应

已知抗体鉴定抗原

颗粒型抗原与相应抗体结合，在有电介质存在的条件下，经过一定的时间，出现肉眼可见的凝集小块

沉淀反应

中和反应

标记抗体或抗原技术

沙门氏菌1-2实验

原理：两个特殊容器中进行，一个装有选择性液体培养基，另一个中有非选择性半固体培养基

抗原抗体结合形成肉眼可见的免疫带

酶联免疫吸附试验ELISA

颗粒抗原：如细菌，病毒等

可溶性抗原：肠毒素，真菌毒素等

定性或定量

操作简单，快速

实验原理

酶与抗体或抗原结合

抗原与抗体的特异性反应

酶催化底物显色，肉眼或仪器进行定性或定量

特异性➕酶的信号放大

必需材料

固相支持物

酶标记的抗原或抗体

辣根过氧化物酶，稳定性好

碱性磷酸酶

酶作用的底物

邻苯二胺（黄色）

四甲基联苯胺（蓝色）

类型

直接法，间接法，夹心ELISA：测定颗粒抗原

竞争法：测定小分子抗原，如真菌毒素

夹心ELISA（sandwich ELISA）

①包被：抗体1 ②洗涤：去除过量、结合弱的试剂 ③加待检样品； ④洗涤； ⑤加酶标记抗体2； ⑥洗涤； ⑦加底物； ⑧终止反应

优点

可同时检测多个样品，可自动化操作，操作简单，商业化

胶体金层析法

原理

鲎（hou)试剂测定法

灵敏的测定阴性菌细胞壁中内毒素方法

原理：内毒素与鲎溶解物之间发生反应，形成一种胶状物，定性或半定量

生物分析及相关技术

实验动物的选择

对受试物的敏感性，性别，年龄，体重

受试物给予方式

饲喂；饮食，饮水

灌胃，胶囊

注射：腹腔，皮下

外科手术

肉毒毒素检验

动物实验中的外科手术处理

绑扎环技术

样品的采集与处理

采样遵循的原则

确定采样方案：耳二级、三级

代表性：随机进行，代表全部食品

无菌操作，防止污染

保持原有的状态：挥发、温度

及时型：采样、送检

采样方案

类型

采样

n：同一批次产品应采集的样品件数

结果判定

c:最大可允许超出m值的样品值

m：微生物指标可接受水平的限量值

M微生物指标的最高安全限量值

二级

三级

食品危害度

I类危害，老人和婴幼儿食品及在食用前可能会增加危害的食品

II类危害，立即食用的食品，食用前危害基本不变

III类危害，食用前经加热处理，危害减小的食品

检验指标对食品重要程度：一般，中等，严重