GB 4789.35-2023乳酸菌检测

新版乳酸菌检测国标，包含规范性引用文件、 术语和定义、 设备和材料、 培养基和试剂、检验程序等。

乳酸菌检测SOP

操作步骤

样品制备

1、 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。 2、 稀释液在试验前应在36℃±1℃条件下充分预热15min～30min。 3、 冷冻样品可先使其在2℃～5℃条件下解冻，时间不超过18h，也可在温度不超过45℃的条件解冻，时间不超过15min。 4、 固体和半固体样品：以无菌操作称取25g样品，置于装有225 mL稀释液的无菌瓶（瓶内预置5个～10个无菌玻璃珠）内，使用振荡器振荡2次，每次30s，制成1:10样品匀液。 5、 液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL稀释液的无菌瓶（瓶内预置5个～10个无菌玻璃珠）中，使用振荡器振荡2次，每次30s，制成1:10的样品匀液。

注：对于固体样品或半固体样品（样品粘度＞生乳），需用称重法进行样品制备和稀释。称量时，应避免将样品撒到三角瓶外面及瓶口和内壁上，以防止由于部分样品无法溶解而造成样品损失。

稀释及培养

1、 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9 mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或微量移液器吸头尖端不要触及稀释液），使用振荡器振荡试管3次，每次10s，制成1:100的样品匀液。 2、 另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管或吸头。

乳酸菌计数

乳酸菌总数

双歧杆菌计数

根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48℃～50℃的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良的MRS琼脂培养基倾注入平皿15mL～20mL，转动平皿使混合均匀。培养基凝固后倒置于36℃±1℃厌氧培养，根据双歧杆菌生长特性，一般选择培养48h，若菌落无生长或生长较小可选择培养至72h，培养后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。

嗜热链球菌计数

根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48℃～50℃的MC琼脂培养基及时倾注入平皿15mL～20mL，转动平皿使混合均匀。培养基凝固后倒置于36℃±1℃有氧培养，根据嗜热链球菌生长特性，一般选择培养48h，若菌落无生长或生长较小可选择培养至72h。嗜热链球菌在MC琼脂平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径2mm±1mm，菌落背面为粉红色。

乳杆菌计数

根据待检样品活菌总数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48℃～50℃的MRS琼脂培养基倾注入平皿15mL～20mL，转动平皿使混合均匀。培养基凝固后倒置于36℃±1℃厌氧培养，根据双歧杆菌生长特性，一般选择培养48h，若菌落无生长或生长较小可选择培养至72h，培养后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。

仅包括双歧杆菌属的计数

根据待检样品双歧杆菌属数量的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，吸取1.0mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1.0mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。及时将15mL～20mL冷却至46℃的MRS琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃厌氧培养48h±2h，可延长至72h±2h。培养后计数平板上的所有菌落数。

注：1、如果质量标准中要求的检测项目为乳酸菌总数，检验报告、检验原始记录等检验依据为GB 4789.35；如果质量标准中要求的检测项目为双歧杆菌数，则检验报告、检验原始记录等的检验依据应为GB 4789.34。 2、培养基需放置于水浴锅中进行恒温，不得使用手背感知温度，因温度过高会将菌烫死，温度过低培养基凝固后不易混匀，同时水浴锅需进行温度监控，可写在《设备使用记录》的校准/验证结果一栏。

不同品项检测乳酸菌菌属及所用培养基举例

注：表格中品项举例仅供参考，具体选用培养基按照产品中实际包括乳酸菌种类进行选择。

菌落计数

1、 选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 2、 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 3、 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

注：1、可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。 2、MRS平板上，计数所有的菌落数。 3、MC典型菌落计数：粉红色、粉红色周围带透明圈，两种形态的菌落全部进行计数。

结果的表述

1、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克或每毫升中菌落总数结果。 2、 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（1）计算： N=∑C/(n1+n2)*d 式中： N——样品中菌落数； ∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d——稀释因子（第一稀释度）。 3、 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 4、 若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 5、 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。 6、若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

菌落数的报告

1、 菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。 2、 菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。 3、称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

注：1、若2个平板上只长了1个菌落：原液检测的，结果统一按照1 CFU/mL(g)报告；10倍稀释的，结果统一按照5 CFU/mL(g)报告； 2、若10倍稀释，平板菌落数分别为2和3，则结果报告应为25，而非30； 3、固体样品结果报告中，尾数非5即0，尾数为其他数字的，结果全部为错误结果； 4、如高稀释度菌落数>低稀释度菌落数，则结果不可报告； 5、如三个稀释度均在计数范围内，则结果不可报告； 6、如所有稀释度均为多不可计，则结果不可报告； 7、如两个稀释度的检测结果均不在30-300范围内，需要将结果统一到一个稀释度后，再比较，确定距离范围最近的数值。如：高稀释度为27，低稀释度为320，需要将27乘以10，用270与320作比较，检测结果以320进行计算； 8、如果高稀释度为28，低稀释度为320，按照最小值报告，报告28乘以稀释倍数。

结果与报告

根据菌落计数结果出具报告，报告单位以CFU/g(mL）表示

检验程序

培养基和试剂

稀释液：商品化试剂。

MRS（Man Rogosa Sharpe）琼脂培养基：商品化培养基。

MRS培养基：蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉提供菌体生长所需的氮源、碳源、维生素、矿物质及其他的营养元素；葡萄糖作为可发酵碳源；锰离子、镁离子、吐温80、柠檬酸三铵、醋酸钠能够促进乳酸菌的生长，并中和细胞毒性物质；磷酸盐作为缓冲剂；琼脂作为凝固剂；

MC（Modified Chalmers）琼脂培养基：商品化培养基。

MC培养基：大豆蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉提供菌体生长所需的氮源、碳源、维生素、矿物质及其他的营养元素；葡萄糖和乳糖作为碳水化合物促进乳酸菌的生长，碳酸钙中和菌体代谢产生的酸，以缓解其对细胞的酸毒性，中性红作为酸碱指示剂；琼脂起凝固作用；该培养基含有10g/L的碳酸钙，为难溶物质，需充分混匀后再倾注平板。同时平板有白色沉淀为正常情况。

莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）和半胱氨酸盐酸盐（Cysteine Hydrochloride）改良MRS琼脂培养基：商品化培养基。

莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐的改良MRS培养基：蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉提供菌体生长所需的氮源、碳源、维生素、矿物质及其他的营养元素；葡萄糖作为可发酵碳源；锰离子、镁离子、吐温80、柠檬酸三铵、醋酸钠能够促进乳酸菌的生长，并中和细胞毒性物质；磷酸盐作为缓冲剂；琼脂作为凝固剂。莫匹罗星锂盐抑制除双歧杆菌外的其他乳酸菌；半胱氨酸盐酸盐起还原剂作用。

设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 1、 恒温培养箱：36℃±1℃。 2、 冰箱：2℃～8℃。 3、 振荡器。 4、天平：感量0.01g。 5、 无菌试管：18mm×180mm。 6、 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。 7、 微量移液器和灭菌吸头:1000μL。 8、无菌瓶：500mL、300mL、250mL、150mL。

术语和定义

乳酸菌lactic acid bacteria 一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称,不能液化明胶、不产生吲哚、革兰氏阳性、无运动、无芽孢、触酶阴性、硝酸还原酶阴性及细胞色素氧化酶阴性反应的细菌。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。

规范性引用文件

GB 4789.35-2023《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》和 GB 4789.34-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验》。