蛋白质提取分离纯化

这是一篇关于蛋白质提取分离纯化的思维导图，主要内容包括：精密度验证，纯化分离，工艺优化，提取，样品制备，文献概述。

蛋白质提取分离纯化

文献概述

实验目的

1. 优化碱溶酸沉法提取 SPI

2. 鉴定 SPI 纯度

3. 为 SPI 标准品的制备，提供基础数据和参考，

实验材料

1. 实验材料

大豆，市售，湖北天门；Sepharose 6B,相对分子质量标准蛋白：pharmacia 公司。

2. 主要试剂

β-巯基乙醇、丙烯酰胺、SDS：Sigma公司。

3. 仪器与设备

自动凯氏定氮仪，752型分光光度计：上海精密仪器公司；UV-265 型紫外可见记录光谱仪：日本日立公司；PHS-3C 型 pH计：上海雷磁仪器厂；SCIENTZ-18N 冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司。

实验方法

1. 提取方法

碱提酸沉法

2. 分离纯化

凝胶层析法

3. 含量纯度测定

凯氏定氮法

SDS-PAGE 法

实验过程

1. 样品制备

1. 碱提酸沉 SPI 提取

1. 反复五次沉淀 SPI

1. Sepharose 凝胶过滤 SPI

实验结果

1. 提取率：82.58%

2. 纯化前： 92.65%

纯化后： 98.56%

纯化效果显著

以大豆粉提油后的豆粕为原料，采用破溶酸沉法提取大豆分离蛋白。以浸提 pH、料液比、浸提温度、浸提时间为考察因素，运用单因素试验和正交试验确定大豆分离蛋白的最佳提取工艺条件，再经5次沉淀和凝胶过滤制得纯化蛋白质，并利用凯氏定氮法和 SDS-PAGE 法鉴定其纯度。结果表明：在碱液 pH8、料液比1：14g/mL、浸提温度50℃、浸提时间 60min时，大豆分离蛋白的提取率达到82.58%，粗蛋白提取物中蛋白质含量为 92.65%。凝胶过滤的目标蛋白图谱呈现单一洗脱峰，SDS-PAGE 图谱只存在少量杂带，纯化后的总蛋白含量为98.56%.

样品制备

大豆粉过40目筛，经石油醚脱脂，最终得 到脱脂大豆粉。

提取

碱提酸沉 SPI 提取

1. 按豆粕与水以1:15的质量比混合，于室温、pH 8.0 条件下搅拌1h。然后将此豆粕水溶液浆渣分离，3000r/min 离心15min，弃沉淀，将上清液调至pH4.5，静置沉淀30min ，再次3000r/min 离心 25min，收集沉淀。

(pH 8.0时，碱性环境将豆粕中大豆蛋白质溶解，pH 4.5时，酸性条件将蛋白质沉淀）

2. 用去离子水洗涤3次后复溶于5倍的蒸馏水中，调节pH至7.5，第三次以30000r/min 离心 25min，弃去上清液，沉淀即为大豆分离蛋白(SPI) 的粗提物。

pH7.5：这是大豆分离蛋白较为稳定的中性环境，有利于后续的分离和纯化。用去离子水反复洗脱三次是为了去除沉淀中的杂质。

工艺优化

单因素实验

确定三水平四因素

正交试验

确定最佳工艺条件

最佳工艺条件为：浸提 pH 8，料液比1：14g/mL，浸提温度50℃, 浸提时间60min。在最佳条件下，大豆分离蛋白的提取率为82.58%，提取物中蛋白质含量为92.65%

纯化分离

反复五次沉淀 SPI

酸沉碱提法制得的大豆SPI经5次沉淀后，得到纯化的蛋白质样品，测定其含量。

Sepharose 凝胶过滤 SPI

用琼脂糖凝胶湿样装柱，用1mol/L NaCl PBS (50mmol/L KH2PO4 -Na2HPO4, pH 7.6)平衡层析柱；样品用 PBS 缓冲液配制，离心去上清液，蛋白质溶液的浓度应低于 10mg/mL（反复实验表明：此浓度下吸附率高，平衡时间短）。然后上柱，以磷酸盐缓冲液作为洗脱液，进行线性梯度洗脱，流速 1.0mL/min, 6mL/管分管收集，采用紫外检测器于280nm处检测，并冷冻干燥，SDS-PAGE 分析。

获得的目标蛋白图谱呈现单一洗脱峰，纯化后的SPI其总蛋白含量达到98.56%.

精密度验证

SPI的SDS-PAGE电泳验证

电泳图谱只存在少量杂带，说明蛋白已具有较高纯度

蛋白质中的氮含量约为16%， 蛋白质含量=氮含量×6.25

蛋白质提取率=提取大豆蛋白的含量/大豆 中蛋白质的含量 ×100%