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粘蛋白结果
这是一篇关于结果的思维导图，包含Akkermansia在胞内积累粘蛋白、Tn诱变系统的建立等。
编辑于2024-04-04 19:33:43- 微生物学
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结果
Akkermansia 在胞内积累粘蛋白
可视化粘蛋白摄入
使用STED显微镜观察荧光素标记粘蛋白聚糖
受到标记的粘蛋白或其降解产物在胞内积累——粘蛋白体，似乎为Akkermansia 特有
探究粘蛋白摄取动力学
使用流式细胞术分析荧光强度变化；活细胞成像实时记录粘蛋白体的形成；以葡聚糖为底物证明粘蛋白体形成具有选择性；加入CCCP处理（减少ATP合酶）证明其形成具有能量依赖性（使用CFDA处理证明CCCP处理不会影响细胞活力）
粘蛋白体形成是一个高度动态的过程
A. muciniphila 获取粘蛋白聚糖具有选择性和能量依赖性
A. muciniphila 可以内化粘蛋白为胞内粘蛋白体，这个过程具有底物选择性以及能力依赖性
Tn诱变系统的建立
为探究A. muciniphila 在粘蛋白上生长的所需求的遗传条件所做的准备——建立基因操作系统/方式
未知功能的蛋白质使A. muciniphila 能利用粘蛋白中生长
探究A. muciniphila 在粘蛋白上生长的所需求的遗传条件
A. muciniphila 在粘蛋白中达到最佳生长状态依赖于氨基酸生物合成
氨基酸生物合成相关基因突变体丰度显著下降，特别是支链氨基酸和精氨基酸
半胱氨酸和蛋氨酸生物合成所需基因/同化硫酸盐代谢所需基因插入Tn的突变体也显著减少，但可以通过添加蛋白质水解物来进行改善
A. muciniphila 利用粘蛋白生长时需要糖苷水解酶
大多数糖苷水解酶在粘蛋白利用过程中不需要；而编码糖苷水解酶的基因子集的突变会导致A. muciniphila 在粘蛋白培养基中的生长缺陷，包括GH2、GH89、GH13、GH43和GH20；糖苷水解酶基因突变的低代表性可能是邻近细胞反式互补的结果
一些编码粘蛋白初始分解步骤的酶的基因的突变会导致特别严重的生长缺陷，包括唾液酸酶（GH33）、岩藻糖苷酶（GH95）和外膜相关内切O-聚糖酶（GH16）等可以体外分解粘蛋白的酶
菌株生长缺陷很大程度上与细菌是否单独生长无关
采取微流控液滴Tn-sep
此观察结果的例外包括参与胶囊生产的基因以及编码唾液酸酶、岩藻糖苷酶和硫酸酯酶的基因
Akkermansia 在粘蛋白中生长所需基因不会优先被粘蛋白诱导
RNA测序：测定在粘蛋白培养基中培养的Tn突变体文库以及无粘蛋白的合成培养基中生长的文库菌株的基因表达
粘蛋白培养集中，103个基因显著上调，主要与聚糖降解和半乳糖代谢有关
菌株在粘蛋白中生长所需的基因与粘蛋白诱导的强烈上调的基因（包括编码O-糖肽酶、磺化酶以及24种糖苷水解酶的基因）之间的相关性很低
A. muciniphila 对于粘蛋白的利用需要与编码菌毛蛋白和集中不受粘蛋白调控的蛋白的相关基因的表达
54/179个基因发生突变导致菌株在粘蛋白培养基中发生生长缺陷，这些基因所编码的蛋白质要么为Akkermansia 特有，要么是PVC超门同源物
这些功能未知的蛋白其中19%含有四肽重复结构域（TPR domain）或与菌毛组装相关。其中Amuc_1100与Amuc_1102可能参与了菌毛或II型分泌（II型分泌：通过细胞膜上的 ABC转运体转运到胞外）
粘蛋白代谢使Akkermansia 能在肠道中竞争生存
探究A. muciniphila 在胃肠道定植所需的基因
使用四种类型小鼠（grem-free小鼠、ASF小鼠、CONV小鼠和Muc2−/−小鼠）进行干预；使用INSeq法测定相对适合性；
有接近一半的基因的在破坏后都会影响小鼠体内利用粘蛋白生长的A. muciniphila 丰度的降低
关键氨基酸的合成，特别是在复杂微生物区系的背景下，是A. muciniphila 成功定植于胃肠道所必需的
A. muciniphila 的表面修饰在肠道定植中起重要作用
以有无微生物群共同培养为区分条件，发现有8个基因（ASR途径）在无其余微生物条件下不会被选择影响定A. muciniphila 的定植与生长
A. muciniphila 在粘蛋白培养基中生长所需的假定蛋白在胃肠道定植中也是必需的（特别是编码具有预测N-甲基结构域或者四肽重复结构域的蛋白质基因）
随着微生物群复杂性的增加，A. muciniphila 定植所需基因必要条件增多
两个基因位点影响了粘蛋白运输系统
运输相关基因（mul ）
MUL1（Amuc_0543 to Amuc_0550 ）——注释为未知功能的蛋白
mul1A（amuc_0544, Mul1A由细胞质膜分泌）
mul1B (amuc_0533 )，蛋白Mul1B与Mul1A在粘蛋白运输中处于同一步骤
MUL2（Amuc_1098 to Amuc_1102 ）——注释为编码菌毛(可能在粘蛋白获取种起关键作用)
mul2A
mul2B
MUL系统的功能是与相关菌毛相结合，可能与其他尚未确定的多位点相结合，以捕获细胞外粘蛋白或粘蛋白片段并将其导入细胞，最终积聚在粘蛋白体中
粘蛋白利用可以调节宿主转录反应
探究MUL系统对A. muciniphila 肠道定植的影响
MUL系统定植肠道的条件
Germ-free小鼠条件下单一菌株均可定植，但无法与WT型A. muciniphila 竞争定植
Akk free小鼠与CONV小鼠中MUL系统突变菌株均不能在有复杂微生物背景下定植生长
amuc_0029 突变菌株也无法与WT型菌株竞争定植与生长
MUL系统和粘蛋白代谢是A. muciniphila 在小鼠胃肠道中定植所必需的，前提是有其他微生物共存；除粘蛋白外，A. muciniphila 可以通过获取其余营养物质定植并生长
缺乏mul1A 与mul1B 的突变菌株均能在Muc2−/− 小鼠胃肠道定植
突变株与WT型株代谢产物不同（短链脂肪酸）
Germ-free小鼠条件下，WT型菌株产生了更高水平的醋酸酯和丙酸酯
Germ-free小鼠条件下，WT型菌株干预产生的醋酸酯/丙酸酯水平比值显著低于 mul1A突变株干预
粘蛋白的利用/粘蛋白代谢过程中A. muciniphila 产生了代谢物可以影响宿主生理
突变株对宿主基因表达情况的影响
germ-free小鼠结肠组织转录组表达情况
影响免疫球蛋白基因类别的基因表达，说明对细菌的普遍防御反应;同时WT型菌株干预与mul1A 突变体菌株干预转录组最显著差异与脂质代谢有关（雌性小鼠）
胆固醇合成基因（Sqle、Hmgcs 和Hmgcr ）以及编码调节胆固醇摄取相关蛋白的基因（Ldlr 和Pcsk9 ） 的表达被WT型菌株抑制；mul1A 突变株干预后无菌小鼠固醇合成相关基因表达显著提升
单细胞RNA测序探究转录组表达情况
胆固醇生物合成基因在结肠上皮细胞以及杯状细胞中表达（有助于干细胞增殖和保持肠上皮的完整性)
结肠对A. muciniphila 干预的反应会直接受到细菌吸收或者代谢粘蛋白和相关糖蛋白能力的影响
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