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分子生物学
根据人民卫生出版社第9版《生物化学与分子生物学》中分子生物学部分进行整理。
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分子生物学
真核基因与基因组
基因的基本结构
基因概述
能够编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的、负载遗传信息的基本单位。
大部分生物中构成基因的核酸物质是DNA；少数生物（如RNA病毒）中是RNA。
基因组成
编码序列
可以在细胞内表达为蛋白质或功能RNA的序列
非编码序列
为表达这些基因所需要的启动子、增强子等调控区序列
特殊结构
外显子（exon）
基因与成熟mRNA分子对应序列
内含子（intron）
位于外显子之间与mRNA剪接过程中被删除部分相对应的间隔序列
顺式作用元件
概述
可影响自身基因表达活性的DNA序列，包括启动子、增强子和沉默子等。
分类
启动子
定义
提供转录起始信号
大部分位于基因转录起始点的上游，某些如tRNA基因的启动子位于下游
分类
RNA Pol Ⅰ 启动子
具有RNA Pol Ⅰ 启动子的基因主要是编码rRNA的基因
核心启动子和上游启动子元件
RNA Pol Ⅱ 启动子
具有RNA Pol Ⅱ 启动子的基因主要是编码蛋白质的基因和一些小RNA基因
起始元件和下游启动子元件
RNA Pol Ⅲ 启动子
具有RNA Pol Ⅲ 启动子的基因包括5S 让RNA、tRNA、U6 snRNA等RNA分子的编码基因
位于转录起始点上游或下游
增强子
定义
增强真核基因启动子工作效率的顺式作用元件，是真核基因中最重要的调控序列，决定一个基因在细胞内的表达水平。
增强子的位置、方向和距离不定，与蛋白质结合发挥作用。
沉默子
定义
抑制基因转录的特定DNA序列，当其结合一些反式作用因子时，对基因的转录起阻遏作用，使基因沉默。
绝缘子
定义
是具有独立调节作用的染色质结构；其可位于增强子或沉默子与启动子之间，亦可位于活化基因与异染色质之间，组织异染色质扩展对活化基因造成的抑制作用。
真核基因组
概述
一个生物体内所有遗传信息的总和|生物体中一套完整单倍体的遗传物质的总和
基因和基因间的非编码序列
人基因组包含细胞核染色体和线粒体染色体
结构
定义
不同的基因功能区域在核酸分子中的分布和排列情况。
特点
不同的生物体，其基因组的大小和复杂程度各不相同，进化程度越高的生物其基因组越复杂。
功能
贮存和表达遗传信息。
分类
真核基因组
真核基因组中存在大量重复序列
分布方式
串联重复序列
散在重复序列
重复频率
高度重复序列
功能
参与复制水平的调节
参与基因表达的调控
参与染色体配对
分类
反向重复序列
卫星RNA
中度重复序列
概况
大多数与单拷贝基因间隔排列，大多不编码蛋白质，编码rRNA的基因也属于中度重复序列。
分类
短分散重复片段、长分散重复片段
单一序列
概况
在单倍体基因组中只出现一次或数次，可编码蛋白质及参与基因转录调节。
分类
微编码RNA和长非编码RNA
注
线粒体DNA结构有别于染色体DNA，为环状分子。
DNA的生物合成
DNA复制基本规律
定义
复制是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。
方式
半保留复制
两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致；体现遗传的保守性，但不绝对。
双向复制
原核生物复制时，DNA从起始点向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。
半不连续复制
DNA一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制。
DNA复制的关键酶体系
DNA聚合酶
常见原核生物的DNA聚合酶
DNA-pol Ⅰ
对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。
DNA-pol Ⅱ
参与DNA损伤的应急状态修复。
DNA-pol Ⅲ
（原核生物复制延长中真正起催化作用的酶）
常见真核生物的DNA聚合酶
DNA-pol α
起始引发，有引物酶活性。
DNA-pol β
参与低保真度的复制。
DNA-pol γ
在线粒体DNA复制中起催化作用。
DNA-pol δ
延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。
DNA-pol ε
在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。
复制中DNA分子拓扑学变化
多种酶参与DNA解链和稳定单链状
DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态
拓扑异构酶Ⅰ
无需ATP，切断DNA双链中的一条链并适时封闭，使DNA松弛。
拓扑异构酶Ⅱ
切断正超螺旋态DNA两股链，断端旋转使DNA超螺旋松弛；后利用ATP使连接恢复。
DNA复制保真度问题
三种机制
遵守严格的碱基配对规律
互补碱基氢键作用
碱基堆积作用（π-π堆积作用）
聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能
复制出错时DNA-pol的及时校读功能
维持工具
原核生物
DNA-pol Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ
真核生物
DNA-pol α/β/γ/δ/ε
原核生物的DNA合成过程
复制起始（DNA解链形成引发体）
DNA解链
Dna A/B蛋白
引发体和引物
引发体是解螺旋酶、Dna C蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构。
引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。
复制的延长过程 （领头链连续复制，随从链不连续复制）
复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。
复制的延长过程 （切除引物、填补空缺、连接切口）
原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点（ter）处汇合。
真核生物的DNA合成过程
真核生物前复制复合物（pre-RC）的形成、激活
真核生物复制的起始与原核基本相似
真核生物DNA复制的延长（延长发生DNA聚合酶α/δ转换）
真核生物复制的终止
端粒酶和逆转录
端粒酶参与解决染色体末端复制问题
端粒
端粒指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。
端粒的结构特点是由末端单链DNA序列和蛋白质构成，其中末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。
端粒的功能是维持染色体的稳定性和DNA复制的完整性。
端粒酶
逆转录酶
端粒酶的组成包括端粒酶RNA、端粒酶协同蛋白、端粒酶逆转录酶。
DNA的损伤（突变）与修复
DNA损伤类型
定义
各种体内外因素所导致的DNA组成与结构的变化。
原因
DNA分子自发性损伤
DNA复制中的错误
DNA的自发性化学变化
碱基的异构互变
T和G存在酮式或烯醇式互变
C和Ａ存在氨基式和亚氨基式互变
碱基的脱氨基作用
碱基丢失（脱嘌呤和脱嘧啶）
活性氧引起的碱基修饰与链断裂
物理因素
紫外线（UV）引起易形成胸腺嘧啶二聚体（TT）。
电离辐射引起大量自由基生成间接导致碱基变化和直接导致脱氧核糖变化。
化学因素
碱基类似物会取代正常碱基掺入DNA链中。
烷化剂使DNA中的碱基烷化致不稳定。
类型
点突变（DNA单一碱基的变异）
转换：同型碱基间的替换。
颠换：异型碱基间的替换。
框移突变
指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。
缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。
插入：发生在异型碱基之间。
倒位或转位
DNA重组使其中一段核苷酸倒置或从一处迁移到另一处。
DNA断裂
DNA损伤后果
概述
DNA的结构发生永久性改变，即突变。
DNA失去作为复制和/或转录的模板的功能。
后果
致死性
基因功能的改变
突变是某些疾病的发病基础
基因型的改变→多态性
突变是进化、分化的分子基础
DNA损伤修复
直接修复
嘧啶二聚体的直接修复：光复活酶
烷基化碱基的直接修复：甲基转移酶等
无嘌呤位点的直接修复：DNA嘌呤插入酶
单链断裂的直接修复：DNA连接酶
错配修复
复制与重组中出现的碱基配对错误
因碱基损伤所致的碱基配对错误
碱基插入和缺失
切除修复
碱基切除修复
过程
识别水解-DNA糖基化酶（去碱基）
子主题
切除-无碱基位点核酸内切酶（去核糖）
合成-DNA聚合酶（修复）
核苷酸切除修复
过程
酶系统识别DNA损伤部位
损伤两侧切开DNA链，去除两切口之间的一段受损寡核苷酸
DNA聚合酶催化合成一段新DNA以填补缺损区
DNA连接酶连接新片段以完成修复
区别
E.coli的NER由Uvr A/B/C/D四种蛋白质组成
人类
类型
全面性基因组NER（GGR）
功能：负责修复整个基因组的损伤
特点：速度慢、效率低
转录偶联性NER（TCR）
功能：负责专门修复正在转录的基因在模板链上的损伤
特点：速度快、效率高
作用方式：NER蛋白质被募集于暂停的RNA酶
意义：将修复酶集中于正在转录的DNA，使该区域的损伤尽快得以修复。
重组修复
同源重组修复
非同源重组修复
其它修复
跨损伤同源修复
SOS修复
（只有在细胞受到严重损伤或复制系统受到抑制时才出现）
RNA的生物合成
转录与复制的异同
RNA合成概述
RNA生物合成是以DNA或RNA单链为模板，4种核糖核苷三磷酸（ATP、GTP、UTP、CTP）为原料，由酶催化合成RNA分子的过程。
RNA合成方式
转录（DNA依赖）
复制（RNA依赖）
转录的特点
转录是基因表达的第一阶段
选择性
模板链和意义链（编码链）
转录单位是一次转录所涉及的DNA区段
不对称性
RNA聚合酶
RNA聚合酶催化RNA的合成
RNA聚合酶不需要引物而直接启动RNA链的合成
原核生物只有一种RNA聚合酶，真核生物则有三种RNA聚合酶
原核生物的转录
原核生物转录和翻译同时进行
转录起始
RNA聚合酶结合到DNA的启动子上
转录延长
RNA Pol核心酶延长RNA链
转录终止
根据是否需要蛋白质因子的参与：ρ因子依赖和非依赖的转录终止方式
真核生物mRNA的转录
真核生物基因转录需要调整染色质结构并需要转录因子协助
染色质结构调整是真核基因转录的必要条件
通过转录因子协同RNA聚合酶介导转录起始
基本转录装置（TF）决定转录起始点
TF Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ
RNA聚合酶Ⅱ催化mRNA的合成
RNA聚合酶Ⅱ与转录因子协同组成转录起始复合物
TF ⅡE和TF ⅡH介导的DNA解链促进RNA聚合酶Ⅱ向前移动
转录延长过程中形成转录泡
转录延长过程需要移动核小体
真核生物蛋白质编码基因没有固定的终止位点
真核生物mRNA的修饰加工
真核生物mRNA由hnRNA经转录加工称为成熟分子
剪接
除去hnRNA中的内含子，连接外显子
剪切
修饰
5'端帽结构
3'端多聚腺苷酸尾
保证mRNA核内向胞质的转位、维系mRMA的稳定性的和mRNA翻译起始的调控
添加
RNA编辑
对基因的编码序列进行转录后的加工
蛋白质的生物合成
翻译：生物细胞以mRNA为模板，按照mRNA分子中核苷酸的排列顺序所组成的密码信息合成蛋白质的过程。
蛋白质的生物合成体系
原料：20种编码氨基酸
酶及蛋白质因子：氨基酰-tRNA合成酶、转肽酶、起始因子、延长因子、释放因子等。
氨基酰-tRNA合成酶催化氨基酸的活化。
转肽酶催化核蛋白体P位上的肽酰基转移至A位氨基酰-tRNA的氨基上，使酰基与氨基结合形成肽键；并受释放因子的作用后发生变构，表现出酯酶的水解活性，使P位上的肽链与tRNA分离。
三种RNA：mRNA、tRNA、rRNA
mRNA是蛋白质合成的信息模板
tRNA具有运载工具和分子“适配器”的双重作用
rRNA是核糖体的重要组分，核糖体是蛋白质合成的场所
其它物质：ATP、GTP、Mg2+、K+
遗传密码的特点
方向性
在mRNA的开放阅读框架区，按5'→3'的方向，从AUG开始。
连续性
编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码子及密码子的各碱基之间既无间隔也无交叉。
简并性
一种氨基酸可具有2个或2个以上的密码子（简并性密码子/同义密码子）为其编码。
摆动性
tRNA的反密码子与密码子配对时，第一、二位碱基配对是严格的，第三位碱基则可以一定的变动。（变偶性）
通用性
线粒体和叶绿体中密码子自成体系。
遗传密码表基本上适用于生物界的所有物种。
抗突变性
防错系统。
①氨基酸的活化
定义：氨基酸与特异的tRNA结合形成氨基酰-tRNA的过程。
酶：氨基酰-tRNA合成酶（统称）
过程
氨基酸和ATP结合到酶的活性中心
AMP和氨基酸结合并伴随着焦磷酸的释放和分解
AMP被tRNA取代后形成氨基酰-tRNA
氨基酰-tRNA从酶上释放
特性
高度特异性
校正活性
肽链合成的起始需要特殊的起始氨基酰-tRNA。
肽链合成
②起始
mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核糖体结合而形成翻译起始复合物的过程。
原核生物翻译起始复合物的形成
核糖体大小亚基分离
核糖体小亚基结合于mRNA的起始密码子附近
起始氨基酰-tRNA结合在核糖体P位
核糖体大亚基结合形成起始复合物
真核生物翻译起始复合物的形成
核糖体大小亚基分离
起始氨基酰-tRNA定位结合于小亚基P位
mRNA与核糖体小亚基定位结合
核糖体大亚基结合
③延长
在mRNA模板的指导下，氨基酸依次进入核糖体并聚合成多肽链的过程。
核糖体循环
耗能过程：消耗4个高能磷酸键。
进位
一个氨基酰-tRNA按照mRNA模板的指令进入并结合到核糖体A位的过程。
需要延长因子EF-Tu与EF-Ts（eEF-1）参与
成肽（转肽）
在肽酰转移酶的催化下，核糖体P位上的肽酰基转移到A位上氨基酰-tRNA的α-氨基上，缩合形成肽键的过程。
转位（移位）
在EF-G（eEF-2）的催化下，核糖体向mRNA的3'-端移动一个密码子的距离，使mRNA序列上的下一个密码子进入核糖体的A位而占据A位的肽酰-tRNA移入P位的过程。
④终止
核糖体A位出现mRNA的终止密码子后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出mRNA、核糖体大小亚基分离的过程。
真核生物只有1种释放因子，而原核生物有3种。
⑤加工
多肽链折叠为天然的三维构象
肽链水解和共价修饰
原核生物的基因表达调控
原核生物基因表达的特点
原核生物独有的转录特征
操纵子模式的普遍性 操纵子学说-操纵子
定义：原核生物的一个转录区段（转录单位）
组成
调控区
上游至少包括启动子与操纵元件两部分；下游是转录终止子
信息区
由串联在一起的2个以上结构基因组成
基本结构
功能
启动子
RNA聚合酶识别及结合-启动转录
操纵元件
结合阻遏蛋白-抑制转录
转录与翻译偶联
空间的偶联
原核生物无细胞核膜，致使核区域和细胞质融为一体，因此转录与翻译是在同一场所进行的。
时间的偶联
一条mRNA上往往串着很多核糖体，转录完成后经过简单的修饰就能立即进入翻译状态。
原核生物mRNA所携带的信息差别很大 多顺反子mRNA的存在
多顺反子mRNA是从几个首尾相连的结构基因（存在于一个操纵子中）一次转录而成
多顺反子mRNA中各顺反子的翻译起始大多是独立发生的，但起始点的效率不尽相同
转录起始调节的分子机制
基因表达调控是以特定的DNA序列和蛋白质结构为基础，是通过分子识别来实现的；其分子机制是蛋白与蛋白、蛋白与DNA的相互作用。
顺式作用元件
概念：与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的特定DNA序列。
原核生物常见顺式作用元件
启动子
阻遏蛋白结合位点
正调控蛋白结合位点
增强子
调控蛋白
概念：与特定DNA作用的蛋白质。
调控蛋白的类型
激活单白（正调控蛋白）：对基因表达有激活作用的蛋白质。
阻遏蛋白：对基因表达有抑制作用的蛋白质。
调控蛋白具有结合DNA所需的结构特征
DNA和蛋白质的相互作用
σ因子和启动子决定转录是否能够起始
启动子决定转录方向
启动子序列影响转录起始效率
σ因子控制特定基因的表达
阻遏蛋白结合操纵元件对转录起始进行负调控
阻遏和解阻遏
乳糖操纵子*是可诱导型操纵子
色氨酸操纵子*是可阻遏操纵子
激活蛋白结合正调控元件对转录起始进行正调控
CAP结合位点的正性调控
增强子的正性调控
*乳糖操纵子
结构

诱导剂：乳糖（异乳糖为直接诱导剂）
调节
葡萄糖效应
正向调节
葡萄糖浓度低、cAMP浓度高
负向调节
葡萄糖浓度高、cAMP浓度低
*色氨酸操纵子
结构
子主题
原核生物转录后调节
真核生物基因表达调控
概述
体现
特定时间和特定的细胞中激活特定的基因
目的
实现“预订”的、有序的、不可逆的分化和发育过程
使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常的生理功能
特征
空间特异性
时间特异性
分类
瞬时调控或可逆调控
相当于原核生物对环境条件变化所做出的反应
包括某种代谢底物浓度、激素水平、酶活性和浓度的调节
发育调节或不可逆调控
（精髓部分）
决定真核生物细胞分化、生长和发育的全过程
特点
真核基因表达调控更复杂、层次更多、环节更多
真核基因的转录与染色质的结构变化相关
真核基因表达以正性调控为主
附
真核基因组的一般构造特点
真核基因组结构庞大
真核细胞转录与翻译非同步
真核细胞基因组不连续
真核细胞基因组非编码区多于编码序列
真核细胞基因组含有大量重复序列
真核细胞的单顺反子mRNA
真核细胞蛋白质的多亚基组成
真核基因多层次调控
真核基因的转录与染色质的结构变化相关
DNA拓扑结构变化
组蛋白的修饰
DNA碱基修饰变化
真核基因表达以正性调控为主
多数真核基因在没有调控蛋白作用时是不转录的，需要表达时就要有激活的蛋白质来促进转录
分类
染色质水平调控
真核基因表达调控的重要环节
概述
分类
影响基因拷贝数量的调控
基因丢失
基因扩增
基因重排
影响染色质结构的调控
组蛋白修饰
组蛋白是真核生物体细胞染色质中的碱性蛋白质 （富含带正电的精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸）
核心组蛋白的结构域：组蛋白的球形折叠区和氨基末端（N末端）结构域
常见部位：赖氨酸和精氨酸
类型：乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化
作用：改变染色质活性
染色质重塑
便于DNA结合调控蛋白
产生特殊蛋白结构域的识别位点
DNA修饰
非编码RNA调控
分述
组蛋白乙酰化修饰
组蛋白乙酰化酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）
乙酰化和去乙酰化的动态平衡
组蛋白甲基化修饰
多发生于H3、H4组蛋白的精氨酸和赖氨酸残基上
精氨酸可发生单甲基化、对称二甲基化和不对称二甲基化 赖氨酸可发生单甲基化、二甲基化和三甲基化
组蛋白甲基转移酶：赖氨酸甲基转移酶（KMTs）和精氨酸甲基转移酶（RMTs） 组蛋白去甲基化酶：赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）
组蛋白密码
DNA甲基化修饰
最早发现的DNA修饰途径之一，是DNA的一种天然修饰方式，广泛存在于细菌、植物和哺乳动物。
主要形式
☆5-甲基胞嘧啶
N6-甲基腺嘌呤
7-甲基鸟嘌呤
DNA甲基转移酶和DNA去甲基酶——动态平衡
甲基化范围、程度通常与基因表达水平呈反比
意义：在基因表达调控、发育调节、X染色体失活和基因组印迹等方面发挥重要作用
影响：甲基化异常与肿瘤的发生有关
转录调控
概述
转录起始是真核基因表达调控的最重要环节
参与转录调控的因素主要是顺式作用元件和转录因子
均存在正调控作用（主要）和负调控作用
分述
顺式元件作用
启动子
组成包括核心启动子和上游启动子
不同基因启动子的组成和数量是可变的
增强子
作用
增强启动子的转录活性的一段DNA序列
特点
增强子对启动子无严格专一性，同一增强子可以增强不同类型启动子的转录活性
从功能上讲，没有增强子存在，启动子通常不能表达活性；没有启动子时，增强子也无法发挥作用
增强子发挥作用的方式通常与距离无关
增强子发挥作用的方式与其序列正反方向无关
决定基因的时间、空间特异性表达
大多为重复序列
沉默子
（负性调控元件）
绝缘子
隔离染色质使相对独立
若位于增强子和启动子之间时，可以阻断增强子对启动子的调控
在异染色质延伸过程中，绝缘子可以充当异染色质传播的屏障
应答元件
可以与某个（类）专一蛋白因子结合从而控制基因特异表达的一段DNA上游序列
转录因子（TF）
概述
定义：在真核细胞中，能够调控RNA聚合酶转录RNA的蛋白质
分类：根据功能特点分类
通用（基本）转录因子
特异性转录因子：转录激活/抑制因子
辅助转录因子
分述
转录激活因子
可能的 作用机制
调控基因表达水平
募集基本转录因子或一些中介蛋白
激活基本转录装置中的酶
招募染色质重塑复合体
调控基因表达的特异性
结构
DNA结合结构域（DBD）
转录激活结构域（TAD）
细胞信号转导
概述
定义
细胞通讯指在多细胞生物体内，细胞始终需要识别与之相邻近的细胞，或者识别周围环境中存在的各种信号（来自于周围或远距离的细胞），并将其转变为细胞内各种分子浓度、活性或位置的变化，从而改变细胞功能。
细胞信号转导指化学信号在靶细胞内的传递过程。
过程
①特定的细胞释放信息物质
②信息物质经扩散或血循环到达靶细胞
③与靶细胞的受体特异性结合
④受体对信号进行转换并启动细胞内信使系统
⑤靶细胞产生生物学效应
细胞化学信号
细胞间化学信号 （第一信使）
存在可溶型和膜结合型两种形式
可溶型信息物质
内分泌激素
分类
类固醇类、氨基酸类、蛋白质或肽类、胰高血糖素
特点
由特殊分化的内分泌细胞分泌
通过血液循环到达靶细胞
大多数作用时间较长
旁分泌激素
分类
细胞因子、可溶性蛋白质或多肽、生长因子、炎症因子、前列腺素
特点
由体内某些普通细胞分泌
不进入血循环，通过扩散作用到达附近的靶细胞
一般作用时间较短
神经分泌
主要即为神经递质
特点
有神经元细胞分泌
通过突触间隙到达下一个神经细胞
作用时间较短
膜结合型信号分子
相邻细胞膜表面分子特异性地相互识别和作用，促使对方发生增生、分化、凋亡等，以达到功能上的相互协调
信息物质为蛋白质或小分子有机化合物
作用距离可为周围或远距离细胞
细胞内化学信号 （第二信使）
化学本质为无机离子、脂类衍生物、核苷酸、糖类衍生物、信号蛋白分子
细胞化学信号受体
概念
受体是一种能够识别和选择性结合某种配体（信号分子）的大分子物质、多为糖蛋白。一般至少包括两个功能区域，与配体结合的区域和产生效应的区域。当受体与配体结合后，构象改变而产生活性，启动一系列过程，最终表现为生物学效应。
概述
细胞经由受体接收细胞外信号
受体是信息分子的接收分子
受体的化学本质是细胞表面或细胞内的蛋白质分子
作用
识别外源信号分子，即配体
转换配体信号，使之成为细胞内分子可识别的信号，并传递至其他分子引起细胞应答
分类
膜受体
主要同亲水性信号分子作用
胞内受体
包括胞浆受体和细胞核受体，同脂溶性信号分子作用
受体与信号分子结合特征
高度专一性、高度亲和力、可饱和性、可逆性
信号转导通路与网络
信号转导通路是指信号分子与膜受体作用后，在细胞内通过各种信号转导分子的相互识别、相互作用，对信号进行转换和传递，最终到达效应分子，构成了信号转导通路。
不同的信号转导通路之间发生交叉调控，形成复杂的信号转导网络系统。
细胞信号转导存在共同的规律和特征
对于外源信息的反应信号的发生和终止十分迅速
信号转导过程是多级酶反应，因而具有级联放大效应，以保证细胞应答的敏感性
细胞信号转导系统具有一定的通用性，使得细胞内有限的信号转导分子可以满足多种受体信号转导的需求
不同信号转导通路之间存在广泛的信号交联互动，一种信号往往可以激活多条信号转导通路
主要的信号转导分子及其作用方式
小分子信使/蛋白质分子信使
分类
GTP结合蛋白
许多信号通路的分子开关
三聚体G蛋白是G蛋白偶联受体介导的信号通路的开关
低分子量G蛋白是多种信号转导通路的开关分子
第二信使
其浓度和分布变化是重要的信号
特点
不属于物质和能量代谢途径中的核心代谢物
在细胞中的浓度或亚细胞部位的分布可迅速改变
作为变构效应剂作用于相应的靶分子
其结构类似物可模拟细胞外信号对细胞功能的影响
阻断该分子变化可阻断细胞对外源信号的反应
分类
环核苷酸（最重要）
cAMP和cGMP
作用为在细胞内调节蛋白质激酶活性
脂类衍生物
作用于相应的靶蛋白分子
钙离子
作用
可经由钙调节蛋白激活信号转导相关的酶类
特点
钙离子在细胞中的分布具有明显的区域特征
钙离子的下游信号转到分子是钙调蛋白（非唯一）
气体
NO
蛋白质激酶
广泛参与细胞信号通路的构成
特点
可逆磷酸化是细胞信号转导通路的重要开关 （蛋白质的磷酸化与去磷酸化是信号转导过程中最重要的调控方式）
不同蛋白质激酶构成多种形式的信号转导通路
细胞内蛋白质磷酸化大部分由蛋白质丝/苏氨酸激酶活化
蛋白质磷酸酶衰减或终止蛋白质激酶诱导的效应
不同蛋白质激酶分子的逐级序贯磷酸化并激活是细胞信号通路的重要特征
蛋白质复合体
细胞信号转导通路和网络的结构基础
特点
是细胞信号转导分子共同构成的基本工作场所
是信号转导过程特异性和精确性的保证
增加了信号调控的层次和方式
分类
蛋白质相互作用结构域（信号转导分子相互作用的结构基础）
特点
一种信号分子中可含有两种以上的蛋白质相互作用结构域，因此可同时结合两种以上的其他信号分子
同一类蛋白质相互作用结构域可存在于不同的分子中，这些结构域的一级结构不同，因此选择性结合下游信号分子
这些结构域没有催化活性
衔接蛋白和支架单白连接信号通路与网络
衔接蛋白连接信号转导分子
支架单白保证特异和高效的信号转导
细胞受体介导的细胞内信号转导
受体分类
细胞内受体
细胞膜受体
离子通道受体
G-蛋白偶联受体
单跨膜受体
受体分述
细胞内受体多通过分子迁移传递信号
离子通道受体将化学信号转变为电信号
离子通道受体是一类自身为离子通道的受体
离子通道的开放或关闭直接受化学配体的控制（配体-门控受体通道）
配体主要为神经递质
离子通道受体的最终作用是导致细胞膜电位改变
离子通道受体可以为阳离子或阴离子通道
G蛋白偶联受体通过G蛋白和小分子信使介导信号转导
GPCR结构上为单体蛋白，其肽链反复跨膜七次（七次跨膜受体）
GPCR这类受体的细胞内部分总是与三聚体G蛋白结合，受体信号转导的第一步反应都是活化G蛋白
不同GPCR可通过不同通路传递信号
GPCR包括cAMP-PKA通路、IP3/DAG-PKC通路、钙离子/钙调蛋白依赖的蛋白激酶通路
酶偶联受体主要通过蛋白质修饰或相互作用传递信号
细胞信号转导异常与疾病
信号转导异常及其与疾病的关系具有多样性
信号转导异常可发生在两个层次
受体异常激活和失能
信号转导分子的异常激活与失活
信号转导异常可导致疾病的发生
信号转导异常导致细胞获得异常功能或表型
细胞获得异常增殖能力
细胞的分泌功能异常
细胞通透性改变
信号转导异常导致细胞正常功能缺失
失去正常的分泌功能
失去正常的反应性
失去正常的生理调节能力
细胞信号转导分子是重要的药物作用靶位
常用的分子生物学技术
印迹技术
定义：印迹法指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
分类
Southern印迹——检测特定的DNA片段
Northern印迹——检测特定的RNA片段
Western印迹——检测特定的蛋白质
PCR技术 （聚合酶链反应）
概念：PCR技术是模拟体内DNA复制的过程，在体外特异性地扩增已知DNA片段的技术。
原理：以DNA双链为模板，以4种dNTP为原料，在耐热Taq DNA聚合酶的催化下，经变性、退火和延伸三个步骤，经若干次循环后，体外大量扩增两引物之间特异DNA片段。
应用：PCR不仅能作为获取目的基因的办法，同时可作为一种有效的检测手段被广泛用于各个方面。
DNA测序
概念：测序即确定一条DNA片段上的碱基顺序。
基因芯片
应用
核酸序列的分析
同时进行高通量基因转录活性分析
DNA重组与重组DNA技术
同源重组
定义
发生在两个相同或相似的DNA同源序列之间的单链或双链核苷酸片段互换的过程。
生物体内最基本的DNA重组方式，又称基本重组。
模式
Hlliday模式
DNA重组技术的工具酶
限制性核酸内切酶
定义：一类核酸水解酶，能够识别双链DNA分子内部的特异序列位点并裂解3',5'-磷酸二酯键。
种类
Ⅰ型
Ⅱ型
能识别DNA双链内部的特异序列并精确切割DNA
Ⅲ型
特点
具有特定的识别序列和切割位点
识别位点通常为6或4对碱基序列
识别的核苷酸序列通常为回文结构
切割方式及末端特征
特殊类型
同尾酶——识别顺序不同，切割产生的黏性末端相同
异源同工酶/同裂酶——识别顺序不同，切割方式不同
DNA连接酶
功能
催化DNA片段连接
DNA聚合酶
功能
合成DNA
常用的DNA聚合酶
DNA聚合酶Ⅰ
具有5'→3'DNA聚合酶活性及3'→5'和5'→3'外切酶活性
Klenow片段
具有5'→3'DNA聚合酶活性及3'→5'核酸外切酶活性
保证DNA复制的准确性
DNA聚合酶Ⅰ在木瓜蛋白酶的作用下水解得到的大片段即Klenow片段
Taq DNA聚合酶
一种热稳定的DNA聚合酶，活性在72℃时最高
无3'→5'外切酶活性
主要用于PCR
逆转录酶
主要用于逆转录酶催化的cDNA合成
末端转移酶
用于给DNA末端加尾以构成黏性末端
不需要模板
基因载体
概念：能携带目的DNA片段并在宿主细胞中复制及（或）表达的DNA分子。
特点：一般具备自主复制起始点、单一酶切位点或整合位点及筛选标志。
分类
按种类
质粒载体
能在宿主细胞内独立自主复制
带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞一定的遗传性状
病毒载体
染色体载体
按功能
克隆载体
能携带外源DNA在宿主细胞中复制扩增的DNA分子
基本特征
自主复制起点：在宿主细胞中携带外源基因一起复制
限制性内切酶的单一酶切位点或整合位点：有一个或多个限制性内切酶的单一酶切位点供外源基因的插入
选择性标志：用于筛选含载体的宿主细胞
表达载体
能携带外源基因在宿主细胞中表达的DNA分子
基本特征
具有克隆必需元件：复制起点、多克隆酶切位点、选择性标志
具有转录必需元件：启动子和终止子
具有翻译必需元件：核糖体结合位点
分类
按宿主细胞不同
原核表达载体
真核表达载体
重组DNA技术的基本过程
目的DNA的分离获取（分）
PCR法（最常用）
基本步骤：变性、退火、延生
模板：基因组DNA或mRNA逆转录合成的cDNA
前提：知道靶序列两端的核苷酸序列，并根据该序列合成适当引物
化学合成法
文库筛选法
从基因组文库和cDNA文库中通过筛选可以获取目的DNA
化学合成-PCR搭桥法
用于不易获得标本的基因合成或人工设计基因的合成
基本原理：以引物搭接方式，经多轮PCR获取目的DNA
载体的选择和准备（选）
根据实验目的选择适宜载体
克隆载体：对DNA片段进行克隆扩增
表达载体：表达所克隆基因编码的蛋白质
考虑目的DNA的大小及受体细胞的种类
目的DNA与载体的重组（连）
黏端连接
单一相同黏端连接
缺点：容易出现载体自身环化现象且目的DNA可双向插入载体
不同黏端连接
优点：避免载体自身环化且目的DNA只能定向插入载体
平端连接
缺点：连接效率较低且存在载体自身环化、目的DNA双向插入现象
黏-平端连接
特点：连接效率介于黏端和平端连接之间，属于定向克隆
通过其它措施产生黏端进行连接
人工接头法：化学合成法获得的、含有限制酶切点的平端双链寡核苷酸
同聚物加尾法
PCR法：通过PCR，在目的基因的两端添加所需的酶切位点
T-A连接
重组DNA转入宿主细胞（转）
受体菌条件
安全、限制酶和重组酶缺陷、处于感受态
感受态细胞：细胞膜通透性增加以容易接受外源DNA的细胞
例：大肠杆菌作为宿主细胞的基本条件
限制酶系统缺陷：外切酶和内切酶活性缺陷
重组整合系统缺陷：细胞的重组酶基因失活
感染寄生缺陷：细胞丧失在人体等宿主中生存的能力
具有较高的转化效率
具有与载体选择性标记互补的表型
导入方式
转化
将外源DNA导入原核细胞（如大肠杆菌）或酵母的过程
转染
将外源DNA导入真核细胞（酵母除外）的过程
方法包括磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、显微注射法、电穿孔法
感染
以病毒颗粒作为外源DNA的转载体将其导入宿主细胞的过程
常用病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等
重组体的筛选与鉴定（筛）
筛选方法
遗传标志筛选法：借助载体的遗传标志进行筛选
插入失活筛选
蓝白筛选（α互补）
序列特异性筛选法：根据重组DNA序列的特点进行筛选
酶切法
PCR法
核酸杂交法
DNA测序法
亲和筛选法：通过重组DNA表达的蛋白质进行筛选
克隆基因的表达
原核表达体系
愿和表达载体的必备条件
表达载体的类型
非融合型表达载体
优点：能够较好地保持原来单白的活性
缺点：在宿主细胞内容易被蛋白酶降解，蛋白产量低；分离纯化费时费力，成本较高
融合型表达载体
优点
目的蛋白稳定性高
目的蛋白易于分离纯化
目的蛋白表达率高
目的蛋白溶解性好
缺点：融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获得目的蛋白
分泌型表达载体
优点
信号肽被切除后，蛋白质N端的氨基酸序列与天然蛋白质一致
蛋白质可以较稳定地存在
蛋白质更容易分离纯化
有利于蛋白质的正确折叠
外源基因在原核细胞中表达的影响因素
外源基因
宿主细胞
SD序列
启动子与密码子
原核表达体系的优缺点
优点
表达系统简单，容易操作
成本低，易于大量生产
生产周期短
缺点
缺乏转录后加工机制
缺乏适当的翻译后加工机制
表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体
很难表达大量的可溶性蛋白质
真核表达体系
分类
酵母表达体系
昆虫杆状病毒表达系统
哺乳动物细胞表达系统
优势
具有转录后加工机制
具有翻译后加工机制
外源蛋白质折叠成正确构象
能准确地定位表达
基因结构与功能分析
启动子的结构和功能分析
启动子，通常是指RNA聚合酶识别、结合和启动转录的一段DNA序列。
启动子的共有序列是启动子的特征性序列
共有序列和启动子所处的位置是研究启动子的重要线索
足迹法分析启动子的结构
酶足迹法
化学足迹法
连接报告基因研究启动子的功能
启动子捕获技术是一种研究启动子活性的筛选方法
转基因技术用于基因功能的研究
转基因技术是将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞中，通过随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA，再将受精卵或胚胎干细胞植入受体动物的输卵管或子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。
应用
利用转基因动物进行基因功能的研究
建立多种疾病的动物模型，研究疾病的发病机理及治疗方法
利用转基因动物生产基因药物
利用转基因动物可以改善动物的生产性能，提高抗病力和适应性
待解决的问题
外源基因插入宿主基因组是随机的，可能产生插入突变，破坏宿主基因组功能
外源基因在宿主染色体上整合的拷贝数目不等
基因打靶技术用于基因功能的研究
基因打靶是通过同源重组定向从细胞染色体上移除或移入特定基因的过程。
分类
基因敲入
基因敲出
疾病相关基因及其鉴定
癌基因
概念：基因组内正常存在的基因，其编码产物通常作为细胞增殖的正调控信号，促进细胞的增殖和生长。
分类
细胞癌基因/原癌基因
代表性细胞癌基因家族：SRC家族、RAS家族、MYC家族
病毒癌基因
基因诊断与基因治疗
基因诊断
基因诊断学基础
概念
利用分子生物学的理论和技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病做出诊断的方法。
特点
高特异性
高灵敏性
早期诊断性
应用广泛性
应用
医学
遗传病
恶性肿瘤
法医学
基因治疗
概念
策略