导图社区 工业生物技术知识导图
本导图总结了工业生物技术下游收货与纯化的知识内容,膜分离、脂多糖去除、去除热原法、蛋白质层析、工业规模,结构型知识结构方便学习记忆!
编辑于2021-08-04 17:20:33工业生物技术 下游-收获和纯化
第32章 膜分离
膜分离的主要应用
产品纯化
离心后上清液的澄清
一个或数个层析工艺,然后膜处理完成后进一步的纯化,最后进行浓缩
过滤除菌
膜过滤法去除病毒
源于血液、细胞培养或最现代的转基因动物的治疗剂中,可能会含有来自原材料的危险病毒污染。这些产品可通过膜设备过滤去除大多数病毒污染,包括人免疫缺陷病毒(HIV)和一直的导致不同肝炎的病毒。
当病毒非常小时,去除是不完全的。
最为早已熟知的通用病毒灭活的额外方法
膜分离工艺
三者都是压力驱动的分离,他们保留组分的大小均不同。
微孔过滤(0.1~10μm),只保留10μm以上的颗粒
超滤(0.001~0.2μm)
反渗透
滤器分类
深层过滤
缠绕棉(wound cotton)
人造丝
聚丙烯
叠层板(如纤维素和玻璃纤维)
表面过滤
筛滤板
第16章 脂多糖,脂多糖去除,去除热原法
内毒素
生物分子或以胞外可溶物表达,或以胞内可溶物表达,或以膜结构、包涵体形式表达。意思三种情况中,通过细胞裂变过程来回收目标生物分子,必然能够释放被称为脂多糖的内毒素。
脂多糖,格兰仕阴性菌的细胞壁组成成分,能够被免疫系统识别,并且能够引发多种生理反应。
当身体与脂多糖过度接触时(如当低浓度的脂多糖进入血液系统时),会出现全身炎症反应,进而引起多种病理生理反应,如内毒素休克、组织损伤甚至致死。
内毒素并不直接作用于细胞或器官,而是通过激活免疫系统,特别是通过白细胞和巨噬细胞释放一系列的促炎介质,如肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白介素6(IL-6)及白介素1β(IL-1β)。
哺乳动物静脉注射低浓度(1ng/ml)
内毒素物理与化学性质
由水溶性多糖和疏水性类脂A(LipA)共价结合组成。
单体的摩尔质量为10-20kDa不等。
由于内毒素的两性结构,其在水溶液能形成多种多样的超分子聚合物。
内毒素在250℃下超过30min或180℃下超过3h会失活。
在实验室中,0.1mol/L以上的强酸或强碱也可以用来破坏内毒素
内毒素作用机制
内毒素不直接作用于细胞或器官,而是通过激活免疫系统,特别是但和细胞和巨噬细胞,从而提高免疫反应。
这些细胞释放介质,如肿瘤坏死因子、若干白介素、前列腺素、菌落刺激因子、血小板活化因子及自由基
这些介质具有强大的生物活性,遇到内毒素时响应副反应。
细胞器官结构和功能的改变
代谢功能的变化
体温升高
激活凝血级联
改变血流动力学
休克
预防和治疗内毒素对免疫细胞的影响
抗内毒素抗体
内毒素受体拮抗剂
内毒素与免疫细胞之间的相互作用不仅由特定受体介导,也由内毒素分子非特异性插入靶细胞细胞膜上介导。
内毒素去除技术
在组氨酸与谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白的纯化过程中,在洗脱步骤中使用0.1%的Triton X-114能成功降低内毒素的浓度,而在洗脱阶段不使用表面活性剂是不能去除内毒素的。
重组人CXCL8(3-7)K11R/G31P(hG31P)蛋白在大肠杆菌表达,通过一步SP-Sepharose层析柱进一步纯化,在洗脱缓冲液中加入0.1%的Triton X-114去除内毒素。
与采用标准协议进行纯化的物料(浓度:2500~34000EU/mg)相比,使用Triton X-114处理后纯化的重组蛋白内毒素浓度能控制到0.2~4EU/mg(比最初的内毒素含量低了99%)。
Teichelt等研究了在洗脱步骤使用Triton X-114能否从等电点在8.5以上的蛋白质中取出内毒素。他们发现将Triton X-114洗脱与亲和层析相结合能有效地从带负电荷的蛋白质中去除内毒素。内毒素的最低浓度能控制到低于0.2EU/mg
Adam等表示,使用Triton X-114可在两部层析后减少100倍的内毒素,内毒素最终含量控制在30EU/mg
Aida和Pabst报道了一个使用Triton X-114去除蛋白液中内毒素的方法。使用Triton X-114的相位分离法能从三中不同的蛋白质(细胞色素c、白蛋白和过氧化氢酶)中去除内毒素。相位分离的第一个循环能够去除1000倍的内毒素,进一步的循环能够完全去除内毒素。
第34章 蛋白质层析,工业规模
工业设计考虑因素
层析操作比较繁琐、昂贵、耗时。在层析之前需要设计高效的工艺方法以使层析步骤最少。
流穿/捕获
如果该步层析的目的是去除低量污染物,那么通常使用流穿模式,使目的蛋白穿出,而污染物与介质结合。与捕获模式相比,使用流穿模式的载量较高,可有效减小柱体积。
流穿模式,样品的电导通常较低,在下步层析之前不需要超滤脱盐。
避免使用捕获模式,可提高回收率,避免挂柱和洗脱时蛋白质的损失。
捕获模式具有浓缩样品的优点
层析放大技术参数的考虑因素
柱高需要保持一致,通过提高柱直径增加载量
使用线性流速
样品或缓冲液(如平衡、洗脱)体积使用柱体积计算
介质倾向于选择大粒径的介质,这样可以降低装柱时的背景压力。柱子的分辨率取决于其含有介质颗粒的数量、介质的表面积以及蛋白质进入介质的扩散率
如果层析柱尺寸没有按照常规原则放大,则需要作出合适的改变,需要改变线性流速,保证蛋白质与介质的作用时间与放大前相当。
坍塌现象:柱子的高度不能过高,通常要低于50cm。
工业规模的层析参数对工艺的影响
在开发一个层析工艺时,在工艺开始之前就要注意到这个工艺的放大的可行性,而层析参数对工艺放大具有显著的影响。这些影响可以通过:设备、试剂、批循环时间和参与生产的人员数等表现出来。
产品的收率和层析步骤的数量需要认真评估。当处于实验室规模时,低收率也许不是问题,但当工艺放大后,低收率和过多的层析步骤将大量地消耗时间和成本
层析的步骤数目是能够制备合格样品所需的最少的纯化步骤。每增加一步层析将增加相应的硬件、软件、操作时间、试剂。此外还将降低产品收率。三步收率为90%的层析将导致总收率为73%。
降低柱体积将显著降低生产成本和操作难度。
柱管及配套硬件
介质量
操作时间
缓冲液
泵
层析介质载量优化十分重要
用高载量的介质
优化层析参数,如流速、上样蛋白浓度、pH、电导
通过流穿模式提高载量
高处理量也是要努力达到的。这可通过提高工艺流速,在保证载量和层析分辨率的前提下尽可能降低保留时间。
在大规模生产时,柱子可能会超压
配套的泵的能力不能达到工艺流速
泵的剪切力对蛋白质有破坏作用
常用的泵有蠕动泵、隔膜泵、多叶回旋泵
层析介质必须有验证证书,保证其可通过过滤去除,而且必须足够稳定以保证可以消毒和再生处理,如耐受高浓度氢氧化钠
工业规模的层析包括的要素
介质
线性流速
介质的硬度决定着流速
动态载量
通常是结合蛋白穿出5%~10%时的上样量
动态载量通常和流速有关。
可清洁性
氢氧化钠是层析过程中最常用的清洁剂,因为它可以灭活细菌和病毒,破坏内毒素,溶解脂类和蛋白质
可重复使用的次数
介质制造商通常不会提供这类信息,需要通过具体工艺考察。这需要将层析规模缩小,反复上样和再生,
结合载量是反应介质寿命的一个常用参数
结合载量比动态载量容易计算
反应了结合在介质上的目的蛋白的总量
若结合载量降低,动态载量必然降低
结合载量是指上样知道介质满载,然后洗脱结合在介质上的蛋白质,计算出结合在介质上的蛋白量
功能稳定性
是否会浸出
理论塔板数
功能基团和基质的脱离情况
可填装性
在使用寿命期间介质的有效性
这需要考察该商品生产厂家生存情况及厂家对该产品的承诺情况
层析柱
316L不锈钢
聚乙烯或聚丙烯
密封圈是最脆弱的
工业规模的层析柱通常使用原味清洁,常使用最高1mol/L的NaCl和2mol/L的NaOH清洗4h。
清洗时,洗涤剂(Triton 100)、离液剂(8mol/L尿素)、低浓度的酸(最高1.7mol/L乙酸、0.1%三氟乙酸、0.1mol/L硝酸)均可使用
层析柱的清洗和再生
批次间的清洗和再生不仅仅是防止批次间污染,更重要的是去除层析柱中的污染物和紧密结合的蛋白质,包装层析柱的柱效
层析介质清洗情况可通过检测过柱的平衡缓冲液中的总有机碳(TOC)来考察。
也可通过X射线光子能谱(XPS)或飞行时间二次离子质谱(Tof-SIMS)来检测介质上污染物的情况
生产设备中常用20%的乙醇控制微生物,在此仅仅是为了控制细菌。如此低的浓度下对病毒和内毒素几乎无效。
氢氧化钠作用的浓度(0.1~1mol/L)、时间、温度及清洗的频率是由清洗挑战试验来决定的。
层析系统
实验室层析系统
Cytiva(GE Heathcare)
Bio-Cad(Applied Bilsystems)
Biologic (Bio-Rad)
中试或小规模生产
Bioprecess系统(GE Heathcare公司)
K-Prine系统(Millipore公司)
在购买之前,层析系统的鉴定工作十分重要,这需要供应商提供文件证明确定该设备能够满足生产需要,同时具有完整保养服务和定期校准服务。
鉴定过程包括4个部分
设计确认(DQ)
描述了层析系统的要求,以及定义它的功能说明和使用说明,如泵的能力、检测器特征、数据分析功能。
需要考察的其他部分包括用户指令、维护需求、验证方法和人员培训
安装确认(IQ)
确定层析系统按照设计规格到货并安装到合适位置。
需要注意的地方
层析系统是否与购买时的承诺一致
是否包括完整的配体文件
使用说明书
维护指南标
标准操作规程
验证证书
安装完成后是否所有部件均发挥作用
使用实验样品进行层析,确证样品的层析图谱是否与生产商提供的参考图谱一致
操作确认(OQ)
用于证明在标准环境下层析系统进行一项特定层析任务的能力,并且证明层析系统能够达到DQ中设定的操作和功能需求。
在进行OQ测试时,最好是对整个系统进行完整测试,而不是隔离地测试系统中的单个元件
测试内容
渗漏测试
基线漂移测试
注入体积准确度
流速准确度
检测其线性度
波长准确度
性能确认(PQ)
是在一系列预设的标准下能够稳定、一致地发挥功能。
为了确定设备的稳定性,需要测试设备多个循环的表现。
PQ根据生产工艺的不同具有不同的测试方法,通常与标准生产工艺接近。
需要使用与生产相同的缓冲液、上样样品、介质、柱高、洗脱条件。
考察指标
峰宽
基线噪声
波长准确度
保留时间
这些工作完成后,需要生成完整的DQ、IQ、OQ和PQ文件。包括OQ和PQ的验证方法及检测结果。需要生成索引以便今后对各个参数分析的查证
一般操作问题
需要合适的再生SOP
上样之前对样品进行预过滤保护层析柱
层析的建立
子主题