导图社区 PCR技术
这是一篇关于PCR技术的思维导图,主要内容包括:实时荧光定量PCR技术(qPcR),PCR产物分析,PCR衍生技术,PCR技术的质量控制,PCR应用,PCR反应过程,PCR原理及反应规律。PCR技术利用DNA在体外特定温度下的变性、复性和延伸三个基本反应步骤,循环复制和扩增DNA片段。
这是一篇关于医学免疫学概论思维导图的思维导图,主要内容包括:医学免疫学展望,免疫学新技术,免疫治疗,免疫病理,免疫调节,免疫应答,免疫系统概述。医学免疫学是研究人体免疫系统对抗外界病原体侵袭的科学,旨在深入了解免疫系统的组成、功能以及在疾病预防、治疗和病原体控制方面的应用。
这是一篇关于抗体的思维导图,主要内容包括:结构,应用,功能,分类,定义。抗体(Antibody,Ab)是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质,主要由浆细胞(效应B细胞)分泌。它是免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质。
这是一篇关于医学免疫学细胞因子思维导图的思维导图,主要内容包括:趋化因子,集落刺激因子 CSF,生长因子,肿瘤坏死因子,干扰素IFN,白细胞介素IL等,细胞因子CK是免疫细胞和某些非免疫细胞受刺激后分泌的、在细胞间发挥相互作用的一组小分子可溶性多肽的总称。
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PCR技术
PCR原理及反应规律
DNA复制
DNA聚合酶
DNA聚合酶的功能
DNA聚合酶的种类
DNA复制的过程
PCR反应体系
模板DNA
引物,人工合成的与待扩增模板两端序列互补配对的寡核苷酸,浓度一般在0.1-0.2微摩尔每升
最大限度地提高扩增效率和特异性
尽可能减少非特异性扩增
dNTP
最适浓度:20~200微摩尔每升
不稳定保存长会失效
Taq酶
耐高温且在70~75° C时具有最高生物学活性
镁离子依赖性酶
Buffer
最适浓度:taq:1.5毫摩尔每升终浓度;pfu:2.0^3.0毫摩尔每升终浓度
Mg2+
PCR反应的特点
特异性强
引物序列及其与模板结合的特异性是决定pcR反应结果的关键
靶基因的特异性和保守性、碱基配对、TaqdNA聚合酶
灵敏度高
指数增长
简便快速
2-4小时完成扩增反应
PCR反应过程
变性;
DNA双链解旋
DNA单链暴露
94°C-95°C Imin足以使模板DNA变性
退火
引物与模板DNA结合
形成DNA复制起点
退火温度二Tm值-5°C
延伸
DNA聚合酶催化DNA复制
形成新的DNA双链
常为72° C
循环次数毛要取决于DNA的浓度。一般为25-35次
PCR产物分析
限制性片段长度多态性分析(RFLP)
优点:分辨率高无需标记,重复性好,简便快速直观
局限:只能应用突变引起限制性酶切位点改变筛选,检测效率低
等位基因特异性寡核苷酸(ASO)
优点:灵敏准确可对大量样品进行筛查和诊断
缺点:效率低
单链构象多态性分析(SSCP)
不同顺序→不同构象→不同电泳行为
优点:操作简便快速,适用于大样本筛查
缺点:不适合分子量大于300 bP片段DNA分析
变性梯度凝胶电泳(DGGE)
高分辨熔点曲线分析
优点:成为低,高通量速度快结果准确
PCR应用
基因克隆
基因表达调控
基因突变检测
基因诊断
基因治疗。
PCR技术的质量控制
建立一个标准的PcR实验室
防止假阳性污染
避免假阴性产生
防止假阴性的措施
充分处理标本暴露DNA
防止抑制酶活性的因素存在
PCR衍生技术
逆转录pcR
多重PCR
原理:在同一反应体系中加入多对引物的同时扩增一份DNA样本中多个基因片段
优点
高效性:在同一PCR反应管中同时对多个型别的目的基因进行分型
简便性
在物证学和医学诊断中非常有用
难点
多对引物的设计
巢式PCR
先用外部引物扩增DNA片段然后用内部引物扩增目的基因片段
用途
用于模板DNA量很少时,目的基因直接引物扩增效率不高时
常用于病原菌的早期检测敏感性高
随机引物PCR
种群生物学研究
基因组DNA图谱构建
临床病菌的流行病学检测和分型
DNA指纹 鉴定
实时荧光定量PCR技术(qPcR)
扩增曲线:荧光背景信号阶段.荧光信号指数扩增阶段和平台期
Ct值:PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环次数
荧光包量PCR的标记检测类型
荧光染料技术
适用于任何DNA
TaqMan探针技术(利用荧光共振能量传递)
特异性高
重复性好
分子信标技术
优点:
荧光背景低
缺点:
只适合于特定目标
设计团难
价格高
荧光探针技术
利用FRET原理建立