导图社区 荧光定量PCR:qPCR
包括原理、步骤、常见问题,在PCR反应体系中加入荧光物质,通过荧光信号的实时接收监测PCR反应进程,由于其模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,以此为依据进而达到定量的目的。
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qPCR
原理
在PCR反应体系中加入荧光物质,通过荧光信号的实时接收监测PCR反应进程,由于其模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,以此为依据进而达到定量的目的。
荧光
SYBR法
SYBR Green结合到双链DNA上,荧光信号急剧增加
优点
目的DNA的量与荧光信号成正比
无序列特异性,可检测多个基因
不足
无法区分不同的PCR产物
无法进行单孔多重PCR
必须要做熔解曲线分析
水解探针法
探针: 序列特异性 淬灭基因 荧光基因
DNA聚合酶
5‘-3’外切酶活性
DNA聚合酶从5‘端合成DNA链,延伸至探针时,将探针降解ei
荧光基因远离淬灭基因,发出荧光
在延伸阶段的最后检测信号
特异性高,无需熔解曲线
可实现多重PCR
步骤
提取RNA
RNA质量分析
逆转录
布板
反应体系
模板(cDNA):2ul;
上游(下游)引物:0.4ul;
无酶水:7.2ul;
预混液Mix:10ul;
dNTPs
PCR缓冲液和辅助因子——提供酶反应的化学反应环境
总体积:20ul
原则
先加大体积,再加小体积
相同组分先混合再加样,要混合均匀
内参基因
设置复孔
阴性对照:用水代替模板,检查是否有扩增
PCR
变性
退火
延伸
分析
熔解曲线
单峰——引物特异性好; 双峰——杂峰在主峰之前,有引物二聚体存在; 杂峰在主峰之后,非特异性扩增(通过调整稀释倍数、减少引物调整)
CT值
扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所需要的循环数; 在扩增曲线上是曲线与阈值交点的横坐标。
内参在15~30之间
过大——提高模板浓度
过小——稀释模板
相对定量法
1)目的基因Ct值的归一化:
ΔCt(实验组)=Ct(实验组的目的基因)-Ct(实验组的内参基因)
ΔCt(对照组)=Ct(对照组的目的基因)-Ct(对照组的内参基因)
(2)实验组ΔCt的归一化:ΔΔCt=各样本的ΔCt-对照组的ΔCt
(3)表达水平的差异倍数:2 –ΔΔCT(次方)
数据处理
1.qPCR结束,得到原始数据,粘贴到Excel表格中,仅保留位置及Cq值(注:Ct值与Cq值表达的意思基本一致。
2.求平均值
3.计算ΔCt,用目的基因的Ct值减去内参基因的Ct值
4.计算对照组ΔCt的平均值
5.计算ΔΔCt,用ΔCt值减去对照组ΔCt的平均值
6.计算2–ΔΔCT(次方)(默认扩增效率100%)
常见问题
1
扩增效率太低(<90%)
原因:扩增子太长,高GC,二级结构,不合适的引物设计、浓度
解决方法:调整引物浓度;设计新引物;减小扩增子长度;存在PCR抑制剂——稀释模板,再纯化模板;使用三步循环程序
2
扩增效率>100%
原因:非特异性扩增,引物和SYBR Green作用
解决:琼脂糖电泳分析、熔解曲线分析、减少引物的量、重新设计引物、替换探针法qPCR检测
3
信号弱或无荧光信号
原因:扩增效率不高;抑制剂存在;模板降解
解决:提高扩增效率——选择扩增效率最佳的退火温度和模板浓度;灵敏度更高的酶;提高镁离子浓度;提高模板纯度;优化引物
4
NTC(阴性对照)不为零
原因:形成引物二聚体;试剂或环境污染
解决:降低引物浓度;确认引物特异性,必要时重新设计引物;配体系时戴手套;配反应体系和加模版在不同的空间进行;PCR完毕后,反应产物拿到别的屋子丢掉,不要在空气中打开;UDG酶处理
5
低表达基因如何优化实验
常规检查: 确 认 熔 解 曲 线 无 问 题 ,N T C 无 扩 增 或 者 C q > 3 8
模板问题排查:模板纯度低、含抑制剂以及模板发生降解、模板投入量过低, 确认模板质量,确认模板加入量;若模板中含有抑制剂如含有:抑制PCR反应, 需要使用耐受抑制剂的mix
程 序 优 化 : 3 步 法 的 程 序 会 提 高 反 应的 扩 增 效 率 , 可 以 由 原 来 2 步 法 变 成 3步 法 。
退 火 温 度 优 化 : 利 用 仪 器 温 度 梯 度功 能 进 行 退 火 温 度 优 化
6
复孔重复性如何优化
加样问题:避免小体积加样,如将mix、引物混合,水和模板混合, 或者其他的混合方法,混合后的体系要充分混匀;m i x 自 冰 箱 拿 出 后 , 要 进 行 混 匀 后 , 才 可 以 使 用 。
移液器要准确:荧光定量PCR可以配套专用准确的移液器,吸取液体时,注意枪头是否漏气,吸取体积是否正确