生物竞赛生物技术

详细的生物技术板块总结，涵盖基因工程、蛋白质工程、blot技术、免疫工程、最新科研技术等，一图看懂全章节内容，知识点系统全面，无需死记硬背，框架式结构清晰明了，轻松掌握知识点，

生物技术

• 基因工程
  • 基因编辑
    • 第一代：ZFNs 锌指核酸酶。利用锌指结构特异结合，FOK1用于非特异性切割
    • 第二代：TALEN(从黄单胞菌属发现）。一AA对应一个核苷酸，细胞毒性降低
    • 第三代：CRISPR/CAS9基因编辑系统
      • 不再需要人工设计蛋白质，更快。但是需要PAM序列。
      • 用一段互补RNA序列识别目标序列
      • CRISPR:成簇规律性间隔短回文重复序列 ; Cas9：双链核酸内切酶
      • gDNA引导CAS9靶向目的基因→DSB引发NHEJ/HDR修复→靶向突变实现基因编辑
      • 已投入在人类上使用，如治疗失明
    • 对第三代进行改造和优化
      • CRISPR/dCas9
        • 将Cas9的RuVc和HNH结构域突变，使Cas9失去切割能力
        • Cas9只进行靶向识别，可以在特定基因上连接转录抑制因子、甲基化酶...
      • CRISPR/C2c2(Cas13a)
        • 用于特定mRNA的knock down
        • 对PAM无要求，原则上可以任意切割
      • Cas9n酶：发生一个D10A突变，导致只有一个核酸酶具有活性
    • 碱基编辑器
      • 胞嘧啶编辑器（CBE）
        • 实质上是dCas、胞嘧啶脱氨酶、尿嘧啶糖基化酶抑制子的融合蛋白
        • C→U-A→T
        • 改良后使用单链切割的方式，切除没有脱氨的单链，避免DSB，叫做nCas9基因编辑
      • 腺嘌呤编辑器（ABE）
        • A→G
      • 先导编辑器（PE)
        • 编辑器（切口酶H840A&逆转录酶MLV）+pegRNA
          • DNA修复酶偏好于从5‘端修复，所以容易清除原始链
  • 分子克隆
    • 获取目的基因
    • 选取载体，然后连接目的基因
      • 区分两种同裂酶和同尾酶
      • 质粒
      • 噬菌体
      • 人工染色体
    • 导入重组DNA
      • 转化
        • 感受态细胞/电转化法
    • 对细胞进行筛选、克隆
      • 表型水平：蓝白斑筛选β-半乳糖苷酶
      • 核酸/蛋白水平检测
      • 克隆
        • TOPO-TA克隆
          • TA克隆法是一种非常常用的PCR克隆技术，通过向PCR产物的3'端添加腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)来实现。但是，TA克隆法在实际应用中有一些限制，如可能会产生无意义的克隆插入、插入序列含有AT富集区域等。为了解决这些问题，推出了TOPO-TA技术，该技术采用了TOPO酶作为克隆体系的核心酶，使得克隆效率和准确性得到了进一步的提高。 TOPO酶是在PCR扩增产物末端添加亲和性特别高的密着荧光染料(TOPO)的一种酶，可以通过简单的混合将PCR产物很快地克隆到TOPO克隆载体上，不需要使用限制性内切酶、连接酶或其他化学品。TOPO-TA技术是通过将PCR产物混合加入PCR2.1-TOPO质粒和TOPO酶，然后在常温下进行缓慢滚动混合，使得所有DNA片段被快速且准确地整合到TOPO质粒上。TOPO酶的优势在于其5’末端磷酸化、3’末端修饰等加工作用，可以极大地提高克隆插入的顺序性和准确性，因此，TOPO-TA克隆方法使得克隆的难度和复杂程度降低，准确性和效率均得到极大提高。
        • RACE克隆
          • RACE Rapid Amplification of cDNA Ends）技术是一种基于PCR的cDNA末端快速克隆技术，主要用于扩增已知cDNA序列的5'端和3'端未知序列。该技术的核心原理包括反转录和PCR两个步骤。
        • Gateway克隆（用到了重组酶，自带筛选）
        • Golden gate 克隆（无缝，没有限制酶的识别序列，但受识别序列限制）
          • 无缝克隆的另一高明之处，就是利用高温。T5外切酶的最适温度是37℃，然而无缝克隆是在50℃下进行的，加之添加的酶单位较少，因此整个反应体系很快便会失去外切的活性，而DNA聚合酶的活性得以维持。而为了保证DNA连接反应顺利进行，无缝克隆采用的是热稳定的Taq DNA连接酶，而非传统的T4 DNA连接酶。同时，为了保证黏性末端能够在50℃下进行互补配对，同源臂的长度一般>15 bp。
          • 与Gibson Assembly比较
            • (1) 片段连接过程中不涉及序列的降解和合成，因此连接产物的保真度更高。
            • (2) 可以组装的DNA片段数量更多，适用于质粒建库。
            • (3) 可以组装带有同源序列或重复序列的DNA片段，比如可用于构建表达多个sgRNA的质粒
            • (4) 可以构建标准化的合成生物学元件，这一点类似于和BioBricks。
        • Gibson assembly克隆（无缝；T5核酸外切酶、Taq连接酶、DNA聚合酶）
          • Gibson连接的原理：通过载体和目的基因两端带有相同的序列后，利用单链核苷酸外切酶消化产生粘性末端，使两者互补配对，再通过修补反应使其完整连接。
          • 最大优势在于其不依赖特定的片段，只需选取载体中的任意位置的片段加到目的基因PCR引物的5‘端，使其扩增后带有该同源序列，就能是目的基因连接至载体上
  • 基因测序
    • 第一代：双脱氧法：Maxam-Gilbert（末端标记+特异切割）
    • 第二代：焦磷酸测序、SOLID测序、ILLUMINA测序、BGI cPAS（边合成边测序，荧光连接）
      • 读长短，通量高，错误率较低
    • 第三代：PacBio SMRT、Oxford Nanopore MinION（还是边合成边测序）
      • 读长长，但错误率偏高；避免了PCR扩增引入错误；可以用于测RNA和甲基化
  • 细胞基因表达
    • 分子开关Tet、Dox on/off
    • Western blot(定性）
    • ELISA(定量）
      • 直接法
      • 间接法：与直接法的区别在于一级抗体没有酶标记，改用二抗的酶标去结合一抗，起到级联放大的作用
      • 夹心法：与前两种方法不同，夹心法先把抗原的一种特异抗体固定在介质上，这样就可以直接检测样本中的抗原，无须纯化固定。而夹心法的劣势在于，由于抗原被夹在中间，头尾需要两种不同的抗原决定簇
    • 免疫组化（IHC）
      • 信号放大技术：酪酰胺信号放大TSA、链亲和素信号放大
  • 小鼠个体实验
    • Cre/loxP实现同向敲除、反向倒位、易位
    • c-fos染色
    • 神经元钙成像
    • 光遗传学
  • PCR（聚合酶链式扩增）技术
    • RT-PCR
      • RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。
    • 实时荧光定量PCR（Q—PCR）
      • 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。
        • 阈值：是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲线指数增长期。 C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数。
    • 90°C变性→（加引物）60°C退火→延伸（Taq DNase、镁离子）
      • Taq酶：保真性不高，因为依赖3→5校正。3’端常突出一个A（非模版依赖的末端转移酶活性）
    • 流程
      • 缓冲液
        • 镁离子：过高引起非特异性扩增和产率提高；过低产率降低
        • Tris-HCl、dNTP
        • 引物：浓度偏高会错配&形成引物二聚体，产率下降
          • 18-25nt，GC占比45-55%，Tm45-65°C
          • 3‘端尽量不用A，不用连续G、C
• 细胞工程
  • 染色技术
    • 嗜酸性：细胞质、线粒体 嗜碱性：染色体、核糖体
    • 苏木精
    • 伊红（BY）
    • 美蓝
      • 瑞士染料：伊红美蓝
      • 将异染粒染成紫红色
    • 番红(木角栓-红粉棕）
    • 固绿
    • 结晶紫
    • 健那绿
    • 醋酸洋红
    • 革兰氏染色（结晶紫、酒精、番红）
      • 结核分支杆菌的胞壁肽聚糖外包裹大量脂质，不能用革兰氏染色，而用抗酸染色法
      • 肽聚糖壁薄的染成粉红色，厚的染成蓝色
    • 吉姆萨染色（伊红美蓝的美蓝被氧化为天青色素，核型分析&染血液疟原虫髓细胞）
    • 齐-尼氏抗酸染色（改良苯酚品红=苯酚+酸性品红，染分枝杆菌）
    • Altman染色（酸性品红，染线粒体）
    • 盐酸间苯三酚（染木质素）
    • 苏丹染液
    • 锇酸（提高对比度）
    • 银染（碱性ph）
    • 酸性磷酸酶（染溶酶体）
    • 鬼笔环肽（标记微丝）
    • 碘化丙啶（PI，染DNA评估细胞活力）
  • 显微镜技术
    • 光学显微镜
      • 偏光显微镜（POL)
        • 
      • 暗场显微镜（DF）
        • 只有衍射光成像
      • 相差显微镜（PH)
        • 
        • 明暗对比，用于观察活细胞的精细结构（边儿亮）
        • 原理：直射光和衍射光的合光成像
      • 微分干涉显微镜（DIC）
        • 浮雕感，观察活细胞精细结构
        • 最佳之选
      • 荧光成像技术
        • 荧光显微镜（FL）
          • 
          • 由于滤光片，一次只能看一种荧光
        • 激光共聚焦显微镜（LSCM）
          • 
          • 优点：光学切片可以在一个样品的不同深度进行拍摄
        • 双光子荧光显微镜（TPFC）
        • 超高分辨率荧光显微镜（STED为王）
    • 亚纳米级（电子）显微镜
      • 辅助技术：冷冻蚀刻技术 超薄连续切片技术（戊二醇和四氧化锇固定，环氧树脂包埋）
      • 透射电镜（TEM）
        • 透射电镜的样品固定需要用戊二醛/多聚甲醛
        • 经常结合超薄切片技术
      • 冷冻电镜（Cryo-EM)
      • 扫描电子显微镜（SEM）
        • 只有它是二次电子信号成像，其他都是透射
        • 可以在真空、大气、常温、变温等不同条件下使用
    • 依靠探针成像
      • 隧道扫描显微镜（STM）
      • 原子力显微镜（AFM）
        • 允许单个大分子成像
• 酶和蛋白质工程
  • 蛋白质研究
    • （一）分离纯化 细胞破碎——沉淀——离心——透析&超滤——层析——电泳 （二）鉴定 分子量——氨基酸组成——氨基酸测序——二硫键定位——结构解析
    • 固相析出分离技术
      • 一般影响因素：盐饱和度、样品浓度、ph=pI时溶解度最低、温度
      • 盐析法（破坏水化膜，可保留活性）
        • 脱盐：超滤、透析、凝胶过滤
      • 有机溶剂沉淀（分辨率更高，易去除易变性）
      • 等电点沉淀（只适合水化程度不高的pro.）
      • 选择性变性（加热、酸碱）
      • TCA沉淀（三氯乙酸在酸性条件聚沉pro.）
      • 有机聚合物沉淀（试剂：聚乙二醇PEG、聚乙烯吡咯烷酮 | 优点：温和、颗粒大、效率高）
      • 蛋白质结晶（过饱和，气相扩散法）
    • 离心
      • 差速离心（颗粒大小、密度、形状存在明显差异时使用）
        • 核糖体没磷脂双分子层，体型较小，所以需要离心力最大，离心时间最长
      • 密度梯度离心（常用CsCl 1~1.9/ml）
    • 过滤与膜分离技术
      • 超滤（分子量＞500）
      • 透析（原理：利用半透膜，水向高渗，分子向低浓度）
    • 萃取技术
      • 双水相萃取（eg.葡聚糖&PEG）
      • 超临界流体萃取（临界温度、临界压力）
      • 反向胶束萃取（去垢剂+水+有机溶剂，去垢剂形成小团）
    • 层析技术
      • 分辨率Rs、比移值Rf
      • 液相层析
      • 吸附层析（影响因素：吸附表面积、温度、浓度、盐度、pH值）
      • 纸层析（被水饱和的滤纸做固定相，有机溶剂做流动相。极性大的亲水）
      • 薄层层析（TLC，支持介质：硅胶、纤维素、凝胶、聚酰胺）
      • 离子交换层析（基质-电荷基团-反离子）
        • PEG分离小分子 交联纤维素、葡聚糖、琼脂糖分离大分子 洗脱：改变离子强度、pH值
        • PH高于等电点带负电，低于等电点带正电
        • 酸性氨基酸在生理PH下带负电，碱性氨基酸带正电
          • 所以阳离子交换层析生理PH下结合碱性氨基酸
        • 带有负电荷的称之阳离子交换树脂；而带有正电荷的称之阴离子树脂（如DEAE）。
      • 凝胶过滤层析（大的绕路走，Vt=Vo+Vi+Vg)
        • 影响因素：柱长&直径、上样量 1~4%、流速
      • 亲和层析（一些供体受体、酶和底物、激素抗体...）
      • 金属螯合层析（His咪唑基）
      • 疏水层析（HIC,反向层析：固定相更加疏水）
      • 高效液相层析（HPLC）
    • 鉴定技术
      • 分子量
        • 凯氏定氮：蛋白质含量=氮量×6.25
        • 紫外吸收
        • 考马斯亮蓝法（即布拉福德反应，吸收峰465→595nm）
        • 双缩脲反应（540nm）
        • 福林酚反应（测酚羟基，比色法750nm/660nm）
        • BCA法（肽键+二价铜→一价铜+2喹啉甲酸，紫色，562nm）
          • 最灵敏
      • 纯净度：OD260/OD280：纯DNA=1.8；>1.8,有RNA污染；<1.8有蛋白质污染
    • 电泳技术
      • SDS-PAGE电泳
        • 各个试剂成分的作用
          • 10%十二烷基硫酸钠(SDS)：阴离子去污剂，使蛋白质带上大量负电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 30%丙烯酰胺（Bis-Acr）：提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否。 10%过硫酸铵APS：提供形成自由基的硫酸盐基团。 TEMED：催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行，加速聚丙烯酰胺的凝固 溴酚蓝（BPB）：上样缓冲液成分。示踪染料，监测电泳进程。 上样缓冲液：可以直接用于细胞或组织样品的裂解，成分有甘油、溴酚蓝、巯基乙醇（二硫苏糖醇）打开二硫键。 分离胶和浓缩胶缓冲液：分离胶pH8.8Tris-HCL，浓缩pH6.8Tris-HCL。 电泳缓冲液：5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 蛋白胶染色液：考马斯亮蓝R250 脱色液：250mL乙醇，50mL乙酸，定容至1000mL Marker：蛋白标准品。
        • SDS破坏不了二硫键
      • 等电聚焦
      • 二硫键定位（对角线电泳）
        • 二硫键的打开用过甲酸或者巯基试剂进行还原
      • 琼脂糖核酸电泳
        • 迁移率影响因素：分子筛效应（越大越慢）、DNA构象：环式>线形>开环、凝胶浓度、电场强度、缓冲液离子强度
    • 氨基酸组成
      • 化学切割（溴化氰切Met羧基端，羟胺切Asn-Gly等）
      • 酶切法
        • 胰蛋白酶，切Lys和Arg羧基侧
        • 胰凝乳蛋白酶，切芳香族羧基侧
        • 溴化氢，切Met羧基侧
        • 胃蛋白酶，比较广泛，疏水AA即可
    • 氨基酸测序
      • N端测序（FNDB、PITC、DNS-Cl）
      • C端测序（胼解法、还原法）
    • 研究蛋白质互作技术
      • 免疫共沉淀Co-IP
        • 反应两个蛋白在体内或细胞水平的相互作用，因为免疫共沉淀检测样本一般源于非变性裂解细胞，是活细胞的检测，反应细胞内真实的蛋白质互作情况
      • GST pull down
        • 更多是在体外实验
      • 亲和层析
      • 荧光能量转移FRET
      • 酵母双杂交
• 核酸研究
  • • 核酸的分离、纯化、定量
      • 核酸的抽取
        • DNA的提取
          • 两种核蛋白分离。常用0.14mol/L和1mol/L的Nacl溶液分别抽取核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白
          • 蛋白质的去除。方法：蛋白酶k的消化不良和酚/氯仿的抽提。核酸溶解在上层水相，蛋白质变性后处于两相界面。
          • 沉淀核酸：用0.6倍体积异丙醇/2倍体积乙醇→离心+70%乙醇沉淀
          • 碱裂解法
            • 
            • 溶液1（分散细胞）
            • 溶液2（裂解细胞）
            • 溶液3 （中和pH，复性，质粒DNA双链重新形成）
              • 然后离心：染色体DNA、细菌蛋白质、破裂的细胞壁相互缠绕沉淀
        • RNA的提取
          • 常用试剂Trizol: 解偶联剂+RNA酶抑制剂
            • RNA酶抑制剂：β-巯基乙醇、8-羟基喹林 解偶联剂：异硫氰酸胍、酚
          • RNA酶
            • 特点：多、坚强（链内二硫键）、自立（无须金属离子） 处理：①180°C烤两小时+ ②3%过氧化氢10min+，再用DEPC 0.1%(结合RNAase咪唑基......) DEPC：即焦炭酸二乙酯，高活性烷化剂，结合RNase的咪唑基；也可以与腺嘌呤作用破坏mRNA；也可以与胺和巯基反应（不与DTT、Tris混用）
          • EDTA(乙二胺四乙酸）：螯合剂，作为核酸酶、蛋白酶抑制剂
          • PMSF（苯甲基磺酰氟）：丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶的抑制剂
        • 研究试剂
          • 浓缩方法
            • 硅胶膜
            • 醇沉淀
          • 去除杂质方法
            • 蛋白质
              • 苯酚氯仿抽提（异戊醇去泡沫）
                • 苯酚：变性、抑制DNase的降解作用
                • 氯仿：加速分层、去除核酸溶液中的微量酚
              • 蛋白酶k
            • 糖类
              • CTAB
            • 多酚
              • β-巯基乙醇
    • 研究核酸&蛋白质互作技术
      • 染色质免疫沉淀CHIP
      • 酵母单杂交
• 各种BLOT嘿嘿
  • Western blot
    • 又称蛋白质印迹，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
    • 步骤
      • 一抗是抗体，二抗是酶标记
      • PVDF膜在使用前应该用甲醇活化
      • 一抗靶向的抗原表位是线性表位（抗原-抗体表位）
    • 各种内参
  • Northern blot、Southern blot
    • 电泳并转膜之后，如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者碱基互补结合。游离探针洗涤后用自显影检测，从而显示待检的片段及其相对大小。
• 生物信息学
  • BLAST技术
    • blastx
      • 将DNA按照6种ORF翻译然后比对。Positive是相似性，identities是一致性。
      • 根据核酸找蛋白质
    • 如果返回的序列太少，说明设定的S值太大，E太小。BLOSUM的矩阵N越大，适用于更相似的序列。
  • 数据库