导图社区 4.酶学检测技术
课本：临床生物化学检验技术（人卫出版社，第一版），本文提炼书中的重点内容，进行归纳整理，涵盖本书所有核心内容，非常方便大家学习。适用于考试复习、预习，提高学习效率。
课本：临床血液学检验技术（人卫出版社 第一版），本文提炼书中的重点内容，进行归纳整理，涵盖本书所有核心内容，非常方便大家学习。适用于考试复习、预习，提高学习效率。
社区模板帮助中心，点此进入>>
英语词性
法理
刑法总则
【华政插班生】文学常识-先秦
【华政插班生】文学常识-秦汉
文学常识：魏晋南北朝
【华政插班生】文学常识-隋唐五代
【华政插班生】文学常识-两宋
民法分论
日语高考動詞の活用
酶学检测技术
概述
酶的分类与特征
组成
少数是核酸，绝大多数是蛋白质
仅具有三级结构的酶称为单体酶 有多个亚基以非共价键连接组成的酶称为寡聚酶 由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶体系称为多酶复合物 几种不同催化功能的酶存在于同一条多肽链中称为多功能酶或串联酶
单纯酶
仅由氨基酸残基组成酶
脲酶、淀粉酶、脂酶、核糖核酸酶等
结合酶
体内的大多数酶
酶蛋白+辅助因子
辅助因子
金属离子
K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等最常见，称为酶的辅基
辅酶
主要是小分子有机化合物
B族维生素及其衍生物
作用是参与酶的催化过程，在酶反应中传递电子、质子或其他基团
分类
酶分子的组成
催化的反应性质
氧化还原酶类
转移酶类
水解酶类
裂合酶类
异构酶类
合成酶类
作用特性
高度不稳定性
高效性
高度特异性
可调节性
同工酶的分类与特征
概念
同工酶是指催化的化学反应相同，但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶
单基因决定同工酶
复等位基因同工酶
多基因决定的同工酶
修饰的同工酶
酶学测定技术
酶活性测定的理论基础
酶具有催化活性，能加快反应速率，测定单位时间内底物消耗量（-d[S]/dt）或产物生成量(d[P]/dt)，计算酶促反应的速率，确定酶活性浓度的高低
酶活性浓度的表示方法
惯用单位
酶学家名字命名
国际单位
在特定条件下，1分钟内转变1微摩尔底物的酶量为一个国际单位，以IU表示，即1IU=1μmol/min。常写作U
Katal单位（Kat）
在规定条件下，每秒钟催化1摩尔底物转化所需要的酶量，1katal=1mol/s
1U=1μmol/min=16.67nmol/s=16.67nkatal
酶活性浓度单位
临床上测定的不是酶的绝对量而是浓度
单位体积所含的酶活性单位数表示，U/L表示体液中酶催化浓度，katal/L报告酶活性浓度
酶促反应进程
延滞期
反应开始的一段时间，此时[S]开始下降，随之有相应[P]逐渐增加
单一酶促反应的延滞期是从反应开始至达到最大反应速度所需要的时间
辅助酶越多延滞期越长，通常1-3min
线性期
检测
延滞期后酶促反应达到最大反应速度并保持相对恒定的一段时期，直线或接近直线状态
非线性期
又称底物耗尽期，是指线性期后反应速率明显下降、酶促反应进程曲线偏离直线的一段时期
酶活性测定方法
定时法
原理
测定酶促反应过程中某一段时间内底物的消耗量或产物的生成量，计算出该时段内的平均反应速度，再换算成μmol/min，以此代表待测酶的活性浓度
需要加入终止剂（强酸、强碱、蛋白沉淀剂等）
特点
优点
①设备简单，操作方便，检测过程中不需要恒温设备，用分光光度计即可测定 ②不用考虑显色剂对酶活性的影响，是早期测定酶活性浓度的常用方法
缺点
无法知道在整个酶促反应进程中是否都是零级反应
计算
标准比较法
标准曲线法
吸光系数法
常用
连续监测测法
最常用
连续监测酶促反应进程中某一反应产物或底物浓度随时间变化的多点数据，找出反应的线性期，求出最大酶促反应速度，从而计算酶活性浓度
速率法
连续监测，可以明确找出反应的线性期，结果可靠准确 标本和试剂用量少，短时间内可完成测量
特定条件（底物浓度足够、温度、pH等反应条件），但分析仪都能搞定
直接连续监测法
直接测定反应体系中待测酶的某一底物或产物的理化特性（吸光度、荧光、旋光性、pH、电导率等）的变化，计算出酶活性浓度
方法简单，但适用范围小
间接连续监测法
一步间接法
在原来反应体系中加入一些试剂，这些试剂不与酶作用也不影响酶的活性，但与产物迅速作用，产生可以被检测的物质
酶偶联法
在原来的反应体系中再加入一些酶试剂，使加入的酶促反应和被测酶的酶促反应偶联起来，最后的反应产物可直接监测，进而推测出第一个酶的活性浓度
以人工合成色素原底物反应为基础的色素原底物连续监测法
以NAD(P)H和NAD(P)+吸光度变化为基础的脱氢酶反应连续监测法
以Trinder反应作指示反应的氧化酶连续监测法
特殊反应类型的连续监测法
酶活性测定的条件优化
最适条件
合适的底物和足够的底物浓度
理想的缓冲液种类和最适离子强度
反应液最适pH
最适反应温度
合适的辅因子、激活剂浓度
酶偶联反应中最适的指示酶和辅助酶用量
合理的测定时间，包括延滞期尽量短暂，有足够的线性期
合适的样本与试剂比例
足够的检测范围
尽量去除各种抑制剂等
底物种类和浓度
底物种类的选择
Km最小的底物，最好是酶的天然底物
Km越小表示酶与底物亲和力越大
足够的溶解度
酶对底物特异性高
底物稳定性好
有较高的临床价值
底物浓度的确定
单底物酶促反应
[S]=10~20Km
双底物酶促反应
具体情况具体分析
缓冲液
种类
活性缓冲液
惰性缓冲液
抑制缓冲液
离子强度
离子强度越高，电解质会干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下降，但离子强度过低也会抑制酶活性
最适pH
最适pH并非酶的特征性常数
反应温度
温度越高，反应活化能越大，酶和底物结合机会越多，反应速度越快
但温度越高，酶的变性失活就会增加
常规实验室越来越多选择37℃
辅酶、辅基和激活剂
结合酶=酶蛋白+辅助因子
预孵育，还要注意金属离子之间的相互拮抗或相互抑制
抑制剂
可逆性抑制
不可逆性抑制
要去除
①高纯度的实验原料和实验用水 ②在反应液中加入金属螯合剂 ③必要时引入副反应去除产物的抑制作用
酶偶联法中的辅助酶和指示酶
选择依据
特异性要高，尤其是指示酶
应尽量减少副反应的发生，提高检测准确度
副反应会使结果偏高
辅助酶的数量尽量少，减少辅助酶可以缩短延滞期
酶偶联反应要合理
能直接偶联就没必要加入辅助酶
尽量选用Km小的指示酶或辅助酶，以缩短延滞期
最适条件尽量与测定酶接近
其他因素
稳定性、纯度、价格和来源等
浓度确定
用量不足→延滞期增长，待测酶的可测范围变窄，严重时不出现线性期
用量过大→成本增加，杂酶的干扰程度增加
影响酶活性测定的方法因素
基本方法因素
方法类型的选择
少用定时法，尽量用连续监测法
正向反应和逆向反应
酶促反应大多是可逆反应，一般根据测定底物或产物的难易程度来选择
原则上选择对底物亲和力大，酶转换率高的方向，还应考虑内源性干扰、底物价格和稳定性等因素
检测底物或检测产物
哪个方便测哪个
底物启动模式与样本启动模式
IFCC推荐法多采用底物启动模式，但需要双试剂
可以消除内源性和外源性干扰
样本启动模式，单试剂
副反应问题
NAD(P)H的光吸收特性使目前使用最多的指示反应
处理方式
副反应抑制剂
样本预处理
延滞期与线性期的确定
检测系统对测定结果的影响
仪器
校准品
实验参数
样本与试剂比例
酶的质量测定
酶质量免疫化学测定法的原理
免疫抑制法
免疫沉淀法
也可测定酶活性浓度
放射免疫法
化学发光免疫分析法
酶免疫法
荧光酶免疫法
···评价
灵敏度高
特异性高
能用于不表现酶活性的酶蛋白
特别适用于同工酶的测定
提纯酶和抗血清要求量大，工作量大
测定步骤多，操作繁琐
测定成本高
代谢物的酶法分析
定义
利用酶的作用特性，以酶作为分析工具或分析试剂的主要成分进行反应体系中底物、辅酶、抑制剂和激活剂等成分含量测定的方法
不需要预处理，可以简化程序
无毒性，无污染
条件温和，可以自动化
理论基础
工具酶
酶学分析中作为试剂用于测定其他化合物浓度或酶活性浓度的酶
平衡法
在代谢物酶促反应中，随着时间的延长，待测物浓度逐渐减少而产物逐渐增多，一定时间后反应趋于平衡，指示反应信号逐渐达到稳定，测定反应达到平衡后底物或产物变化的总量，计算出待测物浓度
该法也称终点法，但反应并未停止，只是达到平衡
Vmax越大，Km越小，[S0]（待测物浓度）越小则达到平衡所需的时间越短
注意事项
①工具酶特异性要高 ②工具酶中的杂酶应低于允许限 ③酶的用量要足够大，以保证反应能在较短时间内（1-3min）达到平衡 ④在保证测定线性的前提下，Km要尽量小 ⑤所用的底物对酶应构成零级反应 ⑥试剂中的添加剂不应抑制酶的活性
又称动力学法，根据酶促反应动力学，准确测定反应的初速度（v），采用标准浓度对照法求得待测物的浓度的方法
根据米氏方程[S]＜＜Km时，且体系中酶量不变，酶促反应的最大速度Vmax也不变，此时，酶促反应呈一级反应
方法设计
直接测定法
直接测定待测底物或产物理化性质的改变来进行定量分析的方法称为直接法
最简单的是单底物反应测定法
单底物反应测定法
最简单
应用
胆红素在胆红素氧化酶（BOD）作用下生成胆绿素，因此胆红素吸光度（450nm）下降
尿酸经尿酸氧化酶（UAO）催化生成尿囊素，导致尿酸在293nm处的吸光度下降来测定尿酸的浓度
双底物反应测定法
一级反应动力学
丙酮酸和乳酸的测定
酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的特性，需将反应生成的某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的
偶联的反应——辅助反应 所用的试剂酶——辅助酶 指示终点的反应——指示反应 指示反应所用的试剂酶——指示酶
非限速反应，辅助反应为一级反应
脱氢酶指示系统
测定氧化型辅酶（NAD+或NADP+）在340nm处吸光度
己糖激酶法测定血清葡萄糖
尿素酶法测定血清尿素
过氧化物酶指示系统
代谢物在酶催化反应中能够生成H2O2，则过氧化物酶（POD）就可以催化H2O2与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚一起形成红色的醌类化合物，该化合物最大吸收峰为500nm，又称为Trinder反应
葡萄糖、胆固醇、尿酸、肌酐、甘油三酯等
酶循环法
利用底物和辅酶的循环反应，使酶促反应产物不断扩增以利于测定的方法。该法使反应产物增加，减少了共存物质的干扰，提高了检测灵敏度和特异性，是酶法分析的发展和延伸
产物循环-氧化酶-脱氢酶系统
脱氢酶-辅酶循环系统
酶激活与抑制测定法
同工酶检测
理化性质
电泳法
层析法
其他性质
底物专一性
AST
免疫学特性
耐热程度
ALP
相关概念
酶（E）是具有催化作用的生物大分子，在生命进程中发挥着重要作用
酶所催化的反应物称为酶的底物（S）
生成物称为产物（P）
酶的催化能力的大小称为酶的活性
