导图社区 细胞生物学研究方法
包括细胞形态结构的研究方法、细胞及其组分的分析方法、细胞培养与细胞工程、细胞及生物大分子的动态变化等内容。
包含了通过细胞融合或拆合、核质交换或核移植、染色体或基因转录以及经由细胞培养和筛选，按照人们预先的设计。
医学细胞生物学第六章线粒体讲述了形态、数量、结构、化学组成、遗传体系、化学渗透学说、核编码蛋白质的转运。
细胞生物学第七章细胞骨架与囊泡运输，讲述了微管、肌动蛋白丝、中间纤维、细胞运动等，希望梳理的内容对你有所帮助！
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细胞生物学研究方法
显微镜技术
光学显微技术
普通显微镜的分辨率
分辨率
显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能分辨被检物体微细结构最小间隔能力
人眼：0.2mm
光镜：0.2μm
电镜：0.2nm
组织切片制备过程
固定
使大分子交联而保持在原有位置上，防止结构移位或丢失。
戊二醛、甲醛
包埋
使组织形成硬块，便于切片
石蜡、树脂
切片
厚度1-10μm
染色
增大反差
相差显微镜用于观察活细胞
暗视野显微镜通过散色光成像
适用于观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和真菌
荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像
荧光
荧光分子可以在吸收特定波长的光后，发射出更长波长的可见光
应用
定性、定位和定量的研究组织内的荧光标记物质
对活细胞内分子的动态变化进行实时观察
共聚焦激光扫描显微镜可以提供高清晰的彩色三维图像
单色激光作为光源
共聚焦：物镜和聚光镜互相共聚焦，只有从标本焦面发出的光线聚焦成像
逐点扫描
连续的光学切片，通过电脑进行三维重建
超分辨光学显微技术
Abbe限度
由于光的衍射效应导致光学显微镜分辨率极限
特点
非接触、无损伤、可观测内部结构的特点
可观测活的组织或细胞，并可进行内部深层三维结构成像
电子显微镜技术
以电子束为光源，波长短，分辨率高
透射电子显微镜TEM
观察内部结构
样品超薄切片
分辨率高
放大倍数高
样品制备
双重固定
锇酸固定脂类，戊二醛固定蛋白质
脱水
含水标本干扰观察
环氧树脂
超薄切片
重金属染色
三维成像
金属投影法
以一定的倾斜角度向样品表面喷重金属，显示投射效果，给出样品表面的三维结构
冰冻断裂
样品快速冷冻-冰刀从脂双层疏水部分撬开-暴露膜内部构造
冰冻蚀刻
冰冻组织-冰刀撬组织-真空中升华-暴露膜结构
观察细胞的内部结构
扫描电子显微镜SEM
样品不用切片
观察表面或断面形态
景深大、立体感
分辨力、放大倍数稍低
冷冻电镜技术
在低温下用透射电子显微镜观察样品的显微技术
高分辨率结构生物学的基础
冷冻电镜
X射线晶体学
核磁共振
主要步骤
样品冷冻
保持蛋白质液态结构
冷冻成像
获得二维透射图像
三维重构
不需要大量样品
不需要结晶
纳米显微技术
1nm-100nm
扫描隧道显微镜
原子力显微镜
通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用力来获取所观察表面的微观信息
可以在固态、液态、气态状况下工作
活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结晶体表面观测进行单个分子操作
细胞分离与培养
第一步：将组织制备成游离的细胞悬液
胰蛋白酶、胶原酶、EDTA
消除细胞间的连接和细胞外基质
细胞分离
密度梯度离心法
利用细胞的密度特性可有效分离不同的细胞
流式细胞仪
从多个细胞悬液中分离目的细胞的精密仪器
用带有荧光的特异抗体标记待分离的细胞
免疫磁珠法
激光捕获显微切割技术
细胞培养
从机体取出组织或细胞，模拟体内的生理环境，使之能够继续生存、生长、繁殖的一种方法
条件
营养条件
培养基
血清
5%CO2
无菌环境
原代培养和传代培养
原代培养
直接取材于有机体组织的细胞培养
传代培养
原代培养的细胞从培养瓶中取出，以2:1以上的比例扩大培养。
细胞系
在培养的细胞中产生'不死'的变异细胞，可以无限繁殖、传代
细胞株
用细胞克隆化的方法进一步改善细胞的均一性，即分离出单个细胞使之增殖形成的细胞群
细胞组分的分离与纯化技术
细胞裂解
破碎细胞
低渗透压
超声震荡
强制通过微孔
机械破碎及研磨
去垢剂
SDS、TritonX-100、NP-40常用于蛋白质的抽提
离液剂
尿素、盐酸胍常用于细胞DNA和RNA的抽提
细胞器及细胞组分的分级离心
差速离心
从低速到高速逐级沉降
体积、质量差别较大的颗粒
速度沉降
在离心管中制备由顶部到底部逐渐增加的蔗糖溶液密度梯度
沉降系数不同的颗粒
平衡沉降
在离心管中制备由顶部到底部高浓度差的蔗糖或氯化铯溶液密度梯度
密度不同的颗粒
蛋白质的分离与鉴定
用层析的方法纯化蛋白质
离子交换层析
凝胶过滤层析
疏水性层析
亲和层析
用电泳的方法分析、鉴定蛋白质
电泳
将含有蛋白质的溶液加上电场，蛋白质分子会根据他们的净电荷多少、大小及形状的不同在电场中移动。
SDS-PAGE
依据分子量的不同分离分离蛋白质
SDS：疏水区与蛋白质的疏水区结合，使带负电荷的亲水端相互排斥，使折叠的蛋白质伸展为多肽链
2-巯基乙醇、二硫苏糖醇
使蛋白质中所有s-s断裂
蛋白质全部带负电荷
等电聚焦电泳
等电点不同
双向电泳
先进行等电聚焦电泳
再进行SDS-PAGE垂直电泳
核酸分离纯化与鉴定
差速离心沉淀是分离纯化常用方法
常用试剂
异硫氰酸胍
使膜脂，蛋白质变性，释放出细胞中的核酸（RNA）分子
氯仿
去除细胞中的脂类，使蛋白质变性，易于核酸分离纯化
蛋白酶k
使DNA酶、RNA酶失活，可裂解细胞
乙醇
沉淀DNA分子
异丙醇
沉淀RNA分子
凝胶电泳是核酸分离鉴定的主要方法
细胞化学和细胞内分子示踪技术
细胞化学技术
一类将细胞形态观察和组分分析相结合的分析方法，在保持组织原有结构的情况下利用大分子，小分子等特性来研究他们在细胞内的分布，数量及动态变化
酶细胞化学法
通过酶对特异性底物的反应并显色来检测酶在器官、组织、细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术
免疫细胞化学技术
利用免疫学中抗原与抗体特异性结合的原理来定性和定位研究器官、组织、细胞中的生物活性分子大分子的技术
放射自显影技术
用放射性同位素标记生物样品中的多分子或其前体物质，然后通过乳胶感光，显示出被标记物在组织和细胞内的位置、数量及其变化
常用同位素：32P、131I、35S、14C、45Ca、3H
弱放射性同位素
活细胞内分子示踪
离子探针进行细胞内离子的实时监测
绿色荧光蛋白用于显示特定蛋白质在细胞内的定位
荧光共振能量转移可实时观察细胞内蛋白质与蛋白质的相互作用
单分子示踪是研究活细胞内大分子行动及功能的重要方法
细胞功能基因组学研究技术
基因表达的定量分析
印迹杂交技术是定量检测基因表达变化的基本方法
southern印迹杂交
DNA检测
northern印迹杂交
RNA检测
western印迹杂交
蛋白质检测
基本步骤
电泳分离待检测样品
将待测分子转移到可方便操作的硝酸纤维素膜或PVDF膜上
将带有报告基因的的探针（抗体）与膜杂交
通过同位素或化学发光试剂显示目的基因的条带
根据条带深浅判断目的基因的含量和分子量的大小
原位杂交可提供基因表达的时空信息
实时荧光定量PCR技术是检测基因表达变化的常规方法
基因表达的上调和下调技术
外源性基因在细胞中的过表达是上调基因表达主要方式
RNA干扰技术是下调基因表达的常用方法
CRISPR/CAS9基因编辑技术
CAS9识别并切割的DNA序列位点还必须有一个PAM区域
蛋白质相互作用的研究技术
免疫沉淀可验证蛋白质-蛋白质相互作用
用耦联在凝胶颗粒或磁珠上的目的基因的抗体将细胞匀浆活裂解液中的目的蛋白沉淀下来，用SDS-PAGE、免疫印迹对沉淀下来的蛋白进行鉴定
酵母双杂交用于筛选存在相互作用的蛋白质
噬菌体展示可筛选存在相互作用的蛋白质
蛋白质和核酸相互作用的研究技术
染色质免疫沉淀技术研究DNA与蛋白质相互作用
用甲醛将细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，用适度的超声波处理将交联复合体打断成片段，将所要研究的目的蛋白的特异性抗体沉淀交联复合体片段，只有与目的蛋白结合的DNA片段才能被沉淀下来，最后去交联和DNA纯化步骤，就可以对与目的蛋白结合的DNA片段进行分析。
紫外交联免疫沉淀研究RNA与RNA结合蛋白的作用
生物芯片技术
基因芯片
蛋白质芯片
蛋白质组学技术
高喷雾电离质谱
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱
高通量测序技术
单细胞测序技术
模式动物个体水平的基因操作技术
