蛋白的研究方法总结

蛋白的研究方法总结思维导图，包含病理组织制片技术、免疫组织化学技术、免疫组织化学技术基本步骤、蛋白质分离技术、蛋白质功能研究等详细总结。

蛋白的研究方法总结

• 病理组织制片技术
  • 取材
    • 动物致死法：麻醉法，空气栓塞法，击头法（狗），脊椎断裂（鼠），股动脉放血法
    • 细胞取材方法：1.印片法2.穿刺法6.沉淀法7.细胞爬片法
    • 1.材料新鲜2.组织块的大小3.物挤压组织块4.规范取材部位 5.选好组织块的切面6.保持材料的清洁7.保持组织的原有形态
  • 固定
    • 目的：防止自溶和腐败，凝固或沉淀细胞内物质，硬化组织，增加组织的折光率
    • 方法，常见问题
  • 洗涤
    • 目的：去掉位于组织结合的固定液及沉淀物，避免组织中留有较多的固定液而妨碍脱水，组织中生成 的沉淀物或结晶而影响染色和观察，可减少甲醛色素
  • 脱水
    • 常用的脱水剂：乙醇，丙酮
    • 方法：自低到高浓度依次进行，使组织中所含水分逐渐减少，直至被脱水剂替代
  • 透明
    • 常见的透明剂：苯，甲苯，二甲苯，三氯甲烷，汽油，香柏油，冬青油，松油醇
  • 浸蜡,包埋
    • 既是透明剂又是包埋剂：石蜡，明胶，火棉胶，树脂，碳蜡
    • 包埋的目的：有利于组织块的妥善保存，有利于切成薄片，可使组织具有一定的硬度和韧性
  • 切片
    • 方法：一整理那块，二准备好切片用具，三安装蜡块，四安装切片刀，五切片的厚度
  • 展片
  • 贴片
  • 烤片
  • 染色
    • 常用的染色方法--苏木素-伊红染色法 简称H.E染色法
    • 方法
      • 脱蜡，脱苯，复水，染色，脱水，透明，封固
  • 封片
• 免疫组织化学技术
  • 免疫组织化学激素的概念和原理
    • 本质：组织化学染色＋原位示踪技术
    • 免疫组织化学的优点
      • 抗原
        • 特性：免疫原性，免疫反应性
      • 抗体
        • 特性：能够与相关抗原特异性结合
      • 酶促反应
        • 特点：高效性，特异性，操作简单，条件可控
    • 免疫组化染色原理
  • 免疫组织化学技术分类
    • 根据标记抗体种类不同
      • 酶--免疫酶法 荧光染料--免疫荧光法 铁蛋白--免疫铁蛋白法 胶体金--免疫金银法 放射性同位素--放射免疫法
    • 根据染色步骤
      • 直接法--免疫荧光探针 间接法--是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和性的某种分子，上检测组织或细胞内的特异性抗原物质
    • 根据结合方式
      • 抗原-抗体结合：例如过氧化物酶--过氧化物酶复合物法 亲和连接法： ABC法，S-P法
  • 常见的染色方法
    • 免疫荧光法
      • 原理：抗原抗体特异性结合
      • 特点：荧光显微镜下观察
    • 免疫酶标方法
      • 原理：抗原抗体反应，酶标记抗体，加底物显色
      • 特色：准，清，久，兼容
    • 免疫胶体金技术
      • 标记物：特殊的金属颗粒-胶体金
      • 特性：特别适用于电镜的单标记或多标记，也适用于光镜研究
  • 免疫组织化学技术特点
    • 原位性
    • 显色反应
    • 形态，代谢和功能三结合
      • 形态：显色反应 代谢功能：抗原含量及位置
    • 定性定位和定量三位一体
      • 存在吗？在哪里？有多少？
    • 特异性强
      • 免疫组织化学实际是组织中特定抗原的显示
    • 敏感性高
      • Abc法sp法可使抗体稀释上千倍上万倍后仍可以与组织中抗原结合
  • 蛋白质结构分析
    • X射线晶体学
      • 利用晶体衍射确定蛋白质三维结构
      • 需要高质量蛋白晶体
    • 核磁共振(NMR)光谱学
      • 利用核磁共振信号分析蛋白质结构
      • 适用于溶液中的蛋白结构分析
    • 电子显微镜
      • 通过电子束成像观察蛋白质结构
      • 高分辨率成像技术
• 免疫组织化学技术基本步骤
  • 取材，固定
    • 目的：保持组织的形态和结构的完整，尽量保存组织中的抗原
    • 方法：4%的甲醛溶液
    • 机理：使蛋白质发生交联而起固定作用影响细胞膜通透性抑制酶的消化作用，从而保护蛋白质免受破坏
  • 组织包埋
    • 目的：使组织保持一定的形状和硬度，易于切片
    • 方法：有多种如石蜡包埋，冷冻包埋，塑料包埋
  • 制片
  • 组织脱蜡
    • 脱蜡：二甲苯溶液6分钟5次，再用乙醇洗掉二甲苯
    • 水化，洗涤：PBS浸泡五分钟
  • 灭活
    • 3%过氧化氢溶液，室温10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性
  • 抗原修复
    • 目的：暴露抗原，提高通透性，增强特异性染色
    • 方法：高压修复，柠檬酸钠盐缓冲液，pH=6.0，0.01M
    • 其他另外方法:消化酶修复,微波修复,煮沸
  • 封闭
    • 目的：消除非特异性染色（存在内源性荧光内源性酶类源性生物素抗体或标记物不纯过量等）
    • 方法：正常山羊血清封闭液封闭，室温下，10分钟，倾去血清
  • 一抗孵育
    • 适当比例稀释I抗，37℃孵育一小时或4℃冰箱过夜
    • PBS洗涤 两分钟三次
  • 二抗孵育
    • 滴加生物素化II抗工作液50~100ul，室温孵育20分钟，pbs洗涤两分钟三次
  • 显影
    • 滴加显色剂
    • 复染
      • 苏木素复染：细胞核0.1%盐酸-乙醇溶液分化
    • 成片
      • 流水充分冲洗 梯度酒精脱水 中性塑胶固定，封片，晾干后镜检
  • 结果判读
• 蛋白质分离技术
  • 电泳技术
    • SDSPAGE
      • 分离不同分子量的蛋白质
      • 利用SDS使蛋白带负电
    • 二维电泳
      • 结合等电聚焦和SDSPAGE
      • 高分辨率分离复杂蛋白样品
  • 色谱技术
    • 离子交换色谱
      • 根据蛋白质表面电荷分离
      • 适用于大规模纯化
    • 亲和色谱
      • 利用特定配体与蛋白的亲和力
      • 高特异性分离目标蛋白
    • 凝胶过滤色谱
      • 根据分子大小分离
      • 用于分子量测定和纯化
  • 蛋白质表达系统
    • 原核表达系统
      • 大肠杆菌表达系统
        • 快速高效表达外源蛋白
      • 重组蛋白表达与纯化
        • 利用标签蛋白进行纯化
    • 真核表达系统
      • 酵母表达系统
        • 适合表达复杂蛋白
      • 昆虫细胞表达系统
        • 用于表达糖基化蛋白
      • 哺乳动物细胞表达系统
        • 用于高度复杂蛋白表达
  • 蛋白质组学研究
    • 蛋白质组学技术
      • 高通量蛋白质鉴定
        • 多种技术联合使用
      • 蛋白质修饰分析
        • 研究翻译后修饰对蛋白功能的影响
    • 生物信息学分析
      • 数据库搜索与比对
        • 利用生物信息学工具分析蛋白质数据
      • 功能注释与网络分析
        • 研究蛋白在生物网络中的作用
• 蛋白质功能研究
  • 基因敲除/敲入技术
    • 通过基因编辑研究蛋白功能
    • 影响蛋白表达或活性
  • 蛋白质相互作用分析
    • 免疫共沉淀(IP)
      • 检测蛋白复合物中的相互作用
    • 双杂交系统
      • 研究蛋白间的相互作用
  • 功能性实验
    • 酶活性测定
      • 评估蛋白的催化活性
    • 细胞生物学实验
      • 研究蛋白在细胞内的作用