2.细胞生物学研究方法

这是一个关于2.细胞生物学研究方法的思维导图，细胞生物学的研究方法多种多样，涵盖了从宏观到微观、从静态到动态、从结构到功能的多个层面。

细胞生物学研究方法

• 显微镜
  • 光学显微镜
    • 分辨率最高达到0.2mm，放大倍数1000倍，人眼0.2mm
    • 组成
      • 光学放大系统：目镜与透镜
      • 照明系统：光源，聚光镜，滤光片
      • 镜架及样品调节系统
    • 分类
      • 普通光学复式显微镜
        • 直接用于观察单细胞生物或体外细培养胞
        • 过程
          • 固定
            • 常用甲醇，会杀死细胞
          • 包埋
            • 常用石蜡
          • 切片
            • 5mm
          • 染色
            • 碱性染料苏木精-蓝紫色细胞核（碱性） 酸性染料伊红（H-E染色）-红色细胞质
      • 相差显微镜
        • 观察活细胞显微结构
        • 利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异 光源为卤素灯
        • 结构
          • 相位板：涂有氟化镁，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ
          • 环状光阑（Annular Ring）：使透过聚光器的光线形成空心光锥，聚焦到标本上
      • 微分干涉显微镜
        • 观察活细胞
        • 在相差显微镜基础上，又称Nomarski相差显微镜 利用平面偏振光为光源
      • 倒置显微镜
        • 物镜与照明系统颠倒，用于观察培养的活细胞
      • 荧光显微镜
        • 观察特定生物大分子，观察细胞动态变化
        • 荧光：某些物质在波长较短的光照射下吸收光能后，原子核周围的电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态，而发出比照射光波长更长的光 （染料吸收一个较短波长的光，散发另一个较长波长的光）
          • FITC (Fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)
            • 最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光
          • Rhodamine B（罗丹明B ）
          • DAPI (4’6-diamidino-2-phenylindole)
            • 一种常用的DNA特异性染料，可以紫外光来激发，发射出明亮的蓝色荧光
        • 特定
          • 利用汞灯或氙灯作为荧光激发光源，波长较短，分辨率高于普通显微镜
          • 滤光片系统：激发滤光片和阻断滤光片组成
        • 荧光素直接标记技术
          • 绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合表达
          • 两种以上荧光素标记同一样品，可同时显示不同成分在细胞中的定位
      • 激光扫描共焦显微镜（LSCM）
        • 观察亚细胞结构（线粒体，中心体，高尔基体）与组分定位及动态变化
        • 利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息，形成清晰的二维图像 可获得一系列不同切面上的细胞照片， 叠加后重构出样品的三维结构
  • 电子显微镜
    • 分辨率到达0.2nm，放大倍数1000000倍
    • 制样技术
      • 超薄切片技术
        • 观察细胞超微结构（亚显微结构，光学显微镜下无法观察）
        • 切片厚度一般在10-50nm
          • 由于电子束穿透能力有限 切片越薄，透射更多，散射衍射越少，分辨率越高
        • 过程
      • 负染色技术
        • 观察纯化后的细胞组分或精细结构
        • 用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色
          • 只染背景而不染样品
          • 凹陷处铺了一薄层重金属盐，而样品凸出的地方则没有染料沉积 背景黑暗，样品透明
      • 冷冻蚀刻技术
        • 观察膜断裂面上的蛋白质颗粒核膜表面形貌特征 观察胞质中细胞骨架及其结合蛋白
        • 过程
          • 样品不需固定包埋
          • 冰冻断裂：液氮液氦等迅速冷冻后低温断裂 蚀刻复型：一段时间冰生化（蚀刻），增强图像立体感
      • 电镜三维重构与低温电镜技术
        • 利用电镜图像进行三维重构
        • 低温电镜
          • 直接冷冻形成100-300nm冰膜
      • 扫描电镜（SEM）技术
        • 可用于观察核孔复合体等更精细结构，但不能观察活生物样品
        • 利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”，激发样品表面放出的二次电子，由探测器收集，转变成光信号、电压信号来控制荧光屏的亮度 二次电子的多少与样品表面结构有关，反映在荧光屏相应部位形成亮或暗的差别，可以得到样品表面的立体形貌（表面突起，二次电子反射多，荧光亮）
        • 样品利用CO2 临界点干燥法进行干燥处理 样品观察前喷镀一层金膜 一般扫描电镜的分辨本领仅为3 nm
  • 扫描隧道显微镜（STM）
    • 可直接观察到DNA,RNA,蛋白质等生物大分子及生物膜，病毒结构。纳米生物学
    • 不破坏生物
    • 可以在真空、大气、液体等多种条件下工作
• 组分分析
  • 超离心技术分离组分
    • 差速离心
      • 利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开
    • 密度梯度离心
      • 将要分离的细胞组分放在密度梯度溶液中，通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率沉降，形成不同的沉降带 （常用介质为蔗糖，氯化铯） 沉降率与形状，大小有关，用沉降系数（S值）表达
      • 分类
        • 速度沉降
          • 用途：分离密度相近而大小不等的细胞组分。 原理：将要分离的样品放置在蔗糖密度梯度溶液的上层，各细胞组分根据大小以不同的速度沉降，而达到分离
        • 等密度沉降
          • 用途：分离不同密度的细胞组分 原理：细胞组分在高密度介质中经离心后沉降到与自身密度相等的介质处，形成不同的密度区带，从而将不同密度的成分分离 非常灵敏，掺入同位素，大肠杆菌DNA实验
  • 特异蛋白抗原的定位与定性
    • 免疫荧光技术
      • 直接免疫荧光技术
        • 荧光分子与抗体偶联后直接用于免疫标记技术
      • 间接免疫荧光技术
        • 先将第一抗体与抗原反应，后加入与荧光分子偶联的第二抗体（抗第一抗体的抗体）
    • 免疫电镜技术
      • 免疫铁蛋白技术
      • 免疫酶标技术
        • 抗体偶联一个酶，抗体结合抗原后，酶可与底物反应完成染色显色
      • 免疫胶体金技术
        • 细菌蛋白A一方面与胶体金结合，一方面与抗体结合
  • 特异核酸定位与定性
    • 原位杂交技术
      • 用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法
      • 在显微与亚显微水平研究基因定位与mRNA表达
  • 细胞成分分析与细胞分选技术
    • 流式细胞术
• 细胞培养与细胞工程
  • 细胞培养
    • 动物细胞培养
      • 分类
        • 原代细胞培养 ：从机体直接取下细胞、组织和器官后 立即进行培养
        • 传代细胞培养：将细胞转移到新的容器中培养。
      • 细胞系
        • 原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，但极少数细胞能够渡过危机存活下来，传40-50代次，这些传代细胞称为细胞系
        • 有限细胞系
          • 传代次数有限
        • 永生细胞系（连续细胞系）
          • 无限制传递培养
      • 细胞株
        • 经生物学鉴定，具有特殊的遗传标记或性质的细胞克隆，称为细胞株
      • 形态 一般不保持体内原有状态
        • 成纤维样细胞
        • 上皮样细胞
        • 可移动游走细胞
    • 植物细胞培养
      • 单倍体细胞培养
        • 用花药或花粉在人工培养基上进行培养，通过发育成胚状体，然后长成单倍体植株 或者从小块植物体（外殖体）通过形成愈伤组织后诱导分化出芽和根，最终长成植株
      • 原生质体培养
        • 将细胞壁去除后，只剩下原生质体进行培养
  • 细胞工程
    • 细胞融合与单克隆抗体技术
      • 两个或多个细胞融合为一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合
      • 方法
        • 动物细胞
          • 生物方式：灭活的病毒（如仙台病毒）介导 化学方式：化学物质（如聚乙二醇，PEG）介导 物理方式：电融合技术
        • 植物细胞
          • 先用纤维素酶去掉纤维素壁，再进行原生质体融合
      • 分类
        • 同核体融合
          • 相同基因型
        • 异核体融合
          • 不同基因型
        • 合核体：一个核中含有来自两个不同亲本染色体的单核子细胞
      • 单克隆抗体筛选
        • HAT培养基筛选完成融合的杂交瘤细胞
          • 细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）。 氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断细胞利用主途径合成DNA。 B细胞不能在体外增殖，而骨髓瘤细胞是HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）基因缺陷细胞， 因此只有从淋巴细胞获得HGPRT基因的骨髓瘤细胞才能在HAT（次黄嘌呤H、氨基蝶呤A 、胸腺嘧啶核苷T）选择培养基中生长。
        • 多孔细胞培养板抗原抗体杂交筛选能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞
    • 显微操作技术与动物的克隆
      • 细胞拆合
        • 把细胞核与细胞质分离开来，然后把不同来源的细胞质和细胞核相互组合，形成核质杂交细胞
        • 分类
          • 物理法
            • 机械法或短波光去除或失活核，再用微吸管吸取其他细胞的核注入去核细胞中
          • 化学法
            • 细胞松弛素B使细胞出现排核现象，再结合离心技术，拆分为核质体与胞质体
      • 显微操作技术
        • 显微镜下用显微操作装置对细胞进行拆合或微量注射，如核移植、显微注射基因等
• 细胞及生物大分子的动态变化
  • 荧光漂白恢复（FPR）
    • 测定脂质或蛋白质在细胞中迁移速率
    • 亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联 高能激光束的照射，使某一区域荧光不可逆淬灭 由于细胞中脂质分子或蛋白质分子的流动性，淬灭区荧光强度逐渐恢复
  • 酵母双杂交技术
    • 研究细胞信号传导网络等系统中各种蛋白质间相互关系的研究
    • 原理
      • 细胞基因转录需要转录激活因子，转录激活因子至少有两个结构域
        • DNA结合域（DB）
          • 识别DNA上特异转录调控序列并与之结合
        • 转录激活域（AD）
          • 与其他成分作用形成转录复合体，启动基因转录
        • 当需要研究A,B蛋白相互作用 分别制备含DB的A蛋白（诱饵），含AD的B蛋白（猎物） 在酵母细胞中二者组装成复合体，启动报告基因转录表达
  • 荧光共振能量转移技术（FRET）
    • 检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用
    • 如果两个蛋白相互作用，其中一个蛋白激发后发出的荧光可激发另一蛋白产生荧光
  • 放射自显影技术
    • 细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术
    • 利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（溴化银或氯化银）的感光作用 放射性同位素放出的电离射线通过乳胶时（曝光过程），射线对溴化银（或氯化银）颗粒产生电离作用后形成潜在影像—“潜影”。经显影剂作用，使潜影部分的溴化银还原为黑色的金属银颗粒
    • 步骤
      • 同位素标记的生物大分子前体的掺入
      • 细胞内同位素的显示