第四章 蛋白质的理化性质、分类及研究方法

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第四章 蛋白质的理化性质、分类及研究方法

• 一、 蛋白质的理化性质
  • 1. 紫外吸收
    • Trp、Tyr和 Phe 三种芳香族氨基酸R基团都有苯环,因而在280nm 波长附近有最大的紫外吸收,绝大多数蛋白质都含有它们,因而也会有紫外吸收现象。核酸最大吸收峰在260nm。
    • 测定 280nm的光吸收已成为对蛋白质进行定性和定量分析最简捷的方法。
  • 2. 两性解离
    • 因其aa残基R基和两端氨基、羧基。较复杂，等电点用等电聚焦或等电点沉淀测定
    • 蛋白质酸性氨基酸残基多则偏酸，碱多则偏碱，差不多则中性偏酸。
  • 3. 胶体性质
    • 有电泳、布朗运动、丁达尔现象、不能通过半透膜等典型的胶体性质
    • 蛋白质形成稳定胶体的原因
      • 胶体如原生质
      • ①蛋白质分子大小已达到胶体质点的范围（1-100nm）,具有较大的表面积
      • ②蛋白质分子表面有许多亲水基团,这些基团与水分子形成氢键,吸附水分子,形成水化膜,使蛋白质颗粒彼此难靠近,增加了蛋白质在aq中的稳定性,防止聚集或沉淀
      • ③在非等电时,同一种蛋白质分子带有同性电荷而相互排斥,不会聚集沉淀。
  • 4. 沉淀反应
    • 能破坏水化膜和(或)能中和表面电荷的物质均会导致溶液中的蛋白质发生沉淀。
    • 导致沉淀的因素
      • 既破坏水化膜又中和电荷的中性盐,中和电荷的等电点 pH、破坏水化膜的有机溶剂、中和电荷的生物碱等
    • 蛋白质不变性分离
      • （1） 盐析
        • 盐溶：在蛋白质溶液中加入的中性盐的浓度较低时,蛋白质溶增加。
        • 在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（硫酸铵）,可使蛋白质溶解度降低并沉淀析出
          • 原理
            • 溶解的盐与蛋白质争夺水分子，破坏水化膜
            • 离子中和表面相反电荷
        • 不同蛋白质的分子大小、带电状况不相同,盐析的盐浓度就不同。可以通过调节盐浓度,使混合液中不同的蛋白质分级沉淀,分离蛋白质,这种方法称为分段盐析。
      • （2） pI沉淀
        • 当蛋白质溶液处于等电点时,蛋白质分子主要以两性离子的形式存在,净电荷为零。此时蛋白质分子失去同种电荷的排斥作用,聚集而沉淀。分离蛋白质和粗测等电点
      • （3） 有机溶剂引起沉淀
        • 与水互溶有机溶剂与水亲和力大，破坏水化膜，蛋白质溶解度降低而沉淀。
        • 低温进行，否则易变性
      • （4） 重金属盐作用
        • pH＞pI，蛋白质带负电，遇重金属离子则形成不溶性蛋白质而沉淀
        • 易失活，少用
  • 5. 蛋白质变性、复性
    • 变性
      • 蛋白质因理化因素作用，三维结构破坏为一级结构，生物活性丧失
      • 我国吴宪提出
      • 蛋白质易变性，因为维持三级结构的是次级键
      • 理化因素
        • 1||| 加热
          • 增加蛋白质平均动能
        • 2||| 冷却
          • 减弱疏水作用
        • 3||| 强酸强碱
          • 破坏盐键
        • 4||| 有机溶剂
          • 极性亲水有机溶剂（乙醇、丙酮）
            • 破坏亲水氨基酸残基侧链之间的氢键
          • 非极性疏水有机溶剂（氯仿）
            • 疏水键破坏
        • 5||| 重金属盐
          • 破坏盐键
        • 6||| 疏水分子（氯仿、苯）
          • 扰乱疏水作用
        • 7||| 去垢剂
          • 亲水头部破坏氢键、离子键等
          • 疏水尾部抢占疏水键结合位点
        • 8||| 尿素
          • 有大量氢键供体、受体抢占氢键结合部位
      • 蛋白质变性后，理化性质改变
        • 1||| 生物活性丧失
        • 2||| 水溶性下降
          • 因为疏水基团外漏。沉降不一定变性、变性不一定沉降。
        • 3||| 更容易被水解
          • 构象变松散、伸展，肽键更易受酸、碱、蛋白酶作用
        • 4||| 粘度增加
          • 肽链伸张，长宽比加大，还与刚性有关。
        • 5||| 结晶行为变化
          • 常丧失，三维结构高度无序
      • 变形应用
        • 功能研究
          • 蛋白质折叠与去折叠状态的能量差异较小,因此有时仅仅一个点突变就能显著改变一种蛋白质对热的稳定性。蛋白质的温度敏感型突变体(temperature sensitive mutant)更容易发生热变性而使用这样的突变体可以帮助鉴定一种蛋白质在细胞内的功能。
        • Taq酶
          • 变性后热稳定性提高。嗜热菌中DNA聚合酶奈一百度高温，可用于PCR
        • 解毒
          • 重金属盐中毒，蛋白质解毒
  • 6. 蛋白质水解
    • 肽键水解
    • 1. 酸水解
      • 硫酸或盐酸（最常用）
      • Trp全部被破坏，羟基氨基酸部分被破坏，Gln→Glu、Asn→Asp
    • 2. 碱水解
      • 大部分氨基酸被破坏，不破坏Trp，消旋现象
    • 3. 酶水解
      • 优缺点
        • 效率高、不消旋、不破坏氨基酸
        • 专一性强，水解部分位点，水解不完全
      • 水解肽键位置不同
        • 水解肽链内部肽键的内切蛋白酶
        • 水解肽链末端肽键的外切蛋白酶
          • 水解N端肽键-氨肽酶
          • 水解C端肽键-羧肽酶
      • 常考
        • 1||| 胰蛋白酶
          • Arg、Lys的C端，右不为Pro
        • 2||| 糜蛋白酶
        • 3||| 胃蛋白酶
        • 芳香族aa的C端，右不为Pro
        • 4||| 嗜热菌蛋白酶
          • 切除疏水性强的aaN端
      • 生物体内只能是酶促水解。有4个重要的生理过程与蛋白酶介导的水解有密切的关系:
        • ①动物消化道内各种蛋白酶对食物中蛋白质的水解作用,蛋白质只有被水解成游离的氨基酸以后才能被消化道有效地吸收
        • ②在真核细胞内,不需要的蛋白质或结构异常的蛋白质在被打上多聚泛酰化标签（即泛素化修饰）以后,被蛋白酶体(proteasome)选择性降解
        • ③执行细胞凋亡(apoptosis)的是胱天蛋白酶(caspase),可将细胞内一些重要的蛋白质水解掉
        • ④真核细胞在自噬(autophagy)的时候,被自噬的蛋白质送往溶酶体或液泡内,在那里被酸性蛋白酶水解
    • 4. 加热
  • 7. 蛋白质颜色反应
    • 常用以定性、定量
    • 双缩脲法、福林-酚试剂法、考马斯亮蓝法； 黄色反应、米伦反应、乙醛酸反应、坂口反应、醋酸铅反应
• 二、 蛋白质的分类
  • 溶解性质不同
    • （1） 白蛋白
    • （2） 球蛋白
    • （3） 组蛋白
    • （4） 精蛋白
    • （5） 醇溶蛋白
    • （6） 谷蛋白类
    • （7） 硬蛋白类
  • 化学组成
    • 简单蛋白质（单纯蛋白质）
      • 水解只有aa
    • 结合蛋白质（缀合蛋白质）
      • 水解除aa外，还有修饰基团、无机分子(金属离子）、辅酶、辅基
      • 非蛋白结构性质
        • 糖蛋白(glycoprotein)-共价结合的糖基； 脂蛋白(lipoprotein)-非共价结合的脂； 核蛋白(nueleoprotein)-非共价结合的核酸； 色蛋白(chromoprotein)-共价结合或非共价结合的生色基团(如血红素)； 金属蛋白(metalloprotein)-配位结合的金属离子； 磷蛋白(phosphoprotein)-共价结合的磷酸基团； 血红素蛋白和黄素蛋白-共价或非共价结合的血红素辅基和共价或非共价结合的黄素(avin)的生物。
  • 按照分子形状、溶解性质以及是否与膜结合
    • 球状蛋白质
    • 纤维状蛋白质
    • 膜蛋白
  • 结构和进化上的亲缘关系
    • 1||| 家族,在进化上具有明确的亲缘关系
    • 2||| 超家族,在进化上可能具有相同的起源
    • 3||| 栏,具有相同的二级结构、相同的排列和相同的拓扑学连接。同一栏的蛋白质一级结构不一定相同，但具有相同的生物学功能。
  • 根据功能
    • 酶、调节蛋白、运输蛋白、贮存蛋白、运动蛋白、结构蛋白、接头蛋白、 保护和防御蛋白、毒蛋白和奇异蛋白等（三章第一节）
• 三、 蛋白质的研究方法
  • 研究重点：性质、结构、功能
  • 一、蛋白质分离纯化
    • （1） 纯化准备工作
      • 1||| 明确纯化蛋白质目的
        • 目的不同，需要的纯度和要求不同。
      • 2||| 目标蛋白的测或方法
        • 是否存在和存在多少-借助生物学活性及活性高低测定。酶-酶活；各种蛋白的功能活性高低
      • 3||| 纯化蛋白质的原料
        • 目标蛋白含量高为原则
    • （2） 注意事项
      • 保护稳定性和活性。①冰上冷库进行②不要太稀③pH合适，可用缓冲溶液④蛋白酶抑制剂以防止降解⑤不要反复冻融、剧烈搅拌⑥缓冲溶液模拟细胞环境⑦缓冲溶液加DTT或巯基乙醇抗氧化⑧加EDTA防金属离子破坏⑨用灭菌aq防止微生物生长
    • （3） 常用方法
      • 1. 沉淀与离心
        • 沉淀-粗提取
          • 溶解性不同。去除杂质；浓缩。
        • 离心-沉降系数（S,与密度和颗粒大小有关）不同
          • 颗粒密度大于其介质溶液密度，则可能沉降
          • 离心机应用方法
            • 沉降离心
              • 离心管内溶液密度一致
              • 差速离心法
            • 梯度离心
              • 将物质放于有密度梯度的的介质中离心
                • 密度梯度离心
                  • 沉降系数不同，依赖时间
                • 平衡密度梯度离心
                  • 密度不同，不依赖时间
      • 2. 透析和超滤
        • 透析
          • 透析(dialysis)是利用蛋白质等生物大分子不能透过半透膜(semipemmeabl membrane),但小分子物质和离子能够通过而进行纯化的一种方法
            • 在装有蛋白质或其他大分子溶液的透析袋外,放入高浓度吸水性强的多聚物(如固体聚乙一醇),透析袋内的水便迅速被袋外多聚物所吸收,从而达到了浓缩袋内液体的目的。
        • 超滤
          • 超滤(ultrafltration)利用具有一定大小孔径的微孔滤膜,在常压、加压或减压条件下对生物大分子溶液进行过滤, 使大分子保留在超滤膜上面的溶液中,小分子物质及水过滤出去,从而达到脱盐、浓缩或更换缓冲溶液的目的,有时还可以用它来进行滤过灭菌。
      • 3. 电泳
        • 等电聚焦电泳（IFE)
          • 凝胶两级建立pH梯度，蛋白质在于其pL相同的pH下聚焦
        • 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
          • 与分子大小、形状、净电荷有关
          • SDS可测定出蛋白质的相对分子质量（大小）、鉴定纯度、确定二硫键定量蛋白质
        • 双向电泳
          • 二维电泳或2D电泳,它由第一向等电聚焦电泳和第二向 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳组成,第一向利用等电聚焦的方法使等电点不同的蛋白得到分离。将第一向电泳的凝胶转移到SDS-PAGE平板顶部，第二项按分子大小分离。结合得到高分辨率蛋白图谱
      • 4. 层析
        • （1） 疏水作用层析HIC
          • 高盐上柱、低盐洗脱
        • （2） 亲和层析
          • 特异亲和力结合（形状互补/特意结合）
            • 1||| 酶&底物/抑制剂
            • 2||| 受体&激素
            • 3||| 抗体&抗原
            • 4||| 带有组蛋白纯化标签的融合蛋白&金属镍
            • 5||| 带有单链DNA结合蛋白纯化标签的融合蛋白&单链DNA
            • 6||| 糖蛋白&植物凝集素【凝集原（抗原决定簇是寡糖）的抗体】
        • （3） 聚焦层析
          • 流动相：多元缓冲剂
          • 固定相：都缓冲交换剂
          • 阴离子交换柱得阳离子产物
        • （4） 凝胶过滤层析
          • 大分子无法进入凝胶颗粒内部，小分子自由进出
        • （5） HPLC（高效液相层析）
          • 最好
    • （4） 蛋白质纯化方案设计
      • 一般过程
        • 1||| 破碎细胞或组织（混合和匀浆）
        • 2||| 去除残渣（离心）
        • 3||| 沉淀或浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）
        • 4||| 纯化（层析）
        • 5||| 鉴定（纯度、大小、等电点）
      • 纯化先分级分离（离心、盐析、速率沉降、平衡密度沉降等）先后不分，经验之谈
      • 操作中，比活（纯度）提高，总活性（酶量）降低。二者折中的方案最优，绘制纯化表
    • （5） 纯度测定
      • 1||| 电泳法
        • 一条带则纯
      • 2||| 化学法
        • PITC进行N端或C端检测，只有一种则纯
      • 3||| 仪器法
        • HPLC
          • 单一的峰则纯
        • 质谱分析
          • Mr与实际一致则纯
  • 二、蛋白质大小的确定（Mr)
    • （1） SDS-PAGE
      • 已知大小蛋白质为标准，进行电泳
    • （2） 凝胶过滤法
    • （3） 超速离心法
      • Mr正比于体积正比于沉降速率S，
    • （4） 质谱法
  • 三、蛋白质等电点测定
    • 等电点沉淀
    • 等电聚焦
  • 四、蛋白质在机体内表达的分析
    • Western印迹
    • 蛋白质与其抗体的结合是高度特异性的,因此可以用它的抗体来对其进行定性和定量分析。然而,抗体本身并没有颜色,偶联的酶可在抗体结合的地方,原地催化反应,并将无色的底物变成有色的产物,显示作为抗原的目标蛋白的存在。将酶偶联在以目标蛋白的抗体(一级抗体)作为抗原制备而成的二级抗体上。 这样的好处是不同蛋白质虽然一级抗体是不同的,但是二级抗体却是通用的。这是因为二级抗体是由一级抗体的不变区作为抗原去免疫另外一种动物制备而成的,来自同种动物不同的一级抗体可变区不一样,但不变区是一样的。 这种方法之所以称为印迹,是因为不同的蛋白质在经凝胶电泳分离后,需要将它们从凝胶上通过吸印的方法转移到机械性能更好的滤膜等材料上,才可以进行后面的鉴定，
  • 五、蛋白质一级结构预测
    • 间接测定
      • 利用“中心法则”，得到蛋白cDNA，测定cDNA碱基序列，找出ORF，根据遗传密码反推氨基酸序列。（真核不行，她有内含子）
      • 优点：快，无需纯化
      • 缺点：无法确定经后加工的蛋白质的最终序列,无法确定修饰的氨基酸，得不到任何二硫键的信息。
    • 间接测定
      • 1. 纯化目标蛋白
      • 2. 拆分肽链
        • 都拆分为单链
      • 3. 打破二硫键
        • 用巯基乙醇或还原性二硫苏糖醇DTT还原二硫键； 用碘代乙酸(iodoacetate)或”γ- 溴代丙胺(γ-bromopropylamine)将还原出来的巯基再氧化,以防止重新形成二硫键
        • 过甲酸氧化二硫键。 将本来通过二硫键相连的 Cys 残基氧化成磺酸基 Cys。带负电荷的磺酸基之间的静电排斥可阻止二硫键重新形成
      • 4. 分析单链的氨基酸组成
        • 酸水解破坏Trp；羟基氨基酸在酸水解条件下也会被破坏,但被破坏的速率较慢,因此可以将在3个时间段(24h、48 h、72 h)得到的3种羟基氨基酸各自的含量回推到零时段其含量；可用来估计蛋白质样品中Asn和Ghn的总含量,但无法得到Asn和Gln各自的含量
        • 反应混合物上柱分离
          • 离子交换层析，洗脱液茚三酮反应定量分析
          • 反向HPLC，上柱前Edman试剂反应，使其转变为HPLC-氨基酸
      • 5. 末端氨基酸检测
        • N端
          • Edman试剂/Sanger试剂
        • C端
          • 酶法
            • 羧肽酶
              • C端除 R、K 和 P 以外的氨基酸,但相邻的 N 端氨基酸不可以是 P
              • C端只能是 R和 K,但相邻的 N 端氨基酸不可以是P
          • 化学法
            • 还原法
              • 使用硼氢化钠将C端氨基酸残基还成氨基醇,从而将它与其他氨基酸区别开来
            • 肼解法
              • 使用无水肼(hydrazine)在 90℃下处理蛋白质20~100h,切开蛋白质分子上所有肽键,产生氨脂酰肼(amino-aevl hydrazide),唯独C端氨基酸以游离的形式出现，通过比较肼解产物与标准氨基酸,因为它的层析行为不变。
      • 6. 将肽链切成小肽，测定各小肽氨基酸序列
        • Edman（为主）能测定小于30个aa的肽段，各种酶为辅
      • 7. 不通气点重复步骤6
        • 重叠序列以排序
      • 8. 根据片段重叠法，推断全序列
      • 9. 二硫键定位
        • 保留目标蛋白上的二硫键,直接用一种蛋白酶水解。找出含有二硫键的肽段以后,再用前面叙述的方法将二硫键拆开,分别测定两个肽段的顺序。在将它们的顺序与已测出的蛋白质一级结构进行比较以后,就能确定相应的二硫键位置。
  • 六、蛋白质三维结构的确定
    • X射线品体衍射、核磁共振波谱法、冷冻电镜、同源建模
  • 七、蛋白质功能的研究
    • 通过观察和分析破坏目标蛋白质基因或抑制目标蛋白质基因的表达而造成的表型变化来研究
    • 基因敲除
    • 基因敲减
  • 八、多肽的固相合成
    • BruceMerrifield
    • 根据事先设计好的多肽序列,先将所要合成肽链的C端氨基酸的羧基以共价键固定到一个不溶性的高分子杯脂上,然后从C端向N端,重复“去保护(除去前一个已与固相树脂相连的氨基酸a-氨基上的保护基团)一活化(激活下一个待连的氨基酸的羧基)一偶联(让去保护的氨基和活化的羧基之间缩合,形成肽键)一洗脱和过滤(去除没有反应完的各种试剂)”这几步反应,直至达到所要合成的肽链长度。然后再除去侧链上的保护基团,最后将肽链从树脂上裂解下来,经过纯化等处理,即可得到所要的多肽。