导图社区 第七章 核酸的理化性质及研究方法
这是一篇关于第七章 核酸的理化性质及研究方法的思维导图，主要内容包括：核酸的理化性质，肽核酸（PNA），核酸的研究技术和方法。
这是一篇关于第六章 核酸的结构与功能的思维导图，主要内容包括：核酸的分类，核酸的一级结构，核酸的二级结构，核酸three级结构，核酸与蛋白质形成的复合物，核酸的功能。
这是一篇关于细胞生物学 第七章 线粒体和叶绿体的结构与功能的思维导图，主要内容包括：线粒体与氧化磷酸化，叶绿体与光合作用，线粒体和叶绿体的半自主性及其起源。
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第七章 核酸的理化性质及研究方法
核酸的理化性质
（1） 紫外吸收
来自碱基
（2） 酸碱解离
磷酸基团，pI较低。DNA的pI=4~4.4；RNA的pI-2~2.5
（3） 粘度
与长度和刚性有关。核酸细长且刚性好，可玻璃棒抽丝。
（4） 沉淀
有机溶剂＋盐浓度。有机溶剂破坏水化层；盐浓度中和表面离子浓度
（5） 变性
指在特定条件下，双螺旋区因氢键和碱基堆积力破坏而解链（不涉及共价键断裂）
1、核酸变性的因素
①加热
热，使核酸分子运动加快，增减内能，破坏氢键和碱基堆积力
但高温会破坏磷酸二酯键，得长短不一单链DNA
②碱性
pH＝11.3，氢键完全破坏（互变异构），DNA全部单链
③低离子强度
盐浓＜0.01mol/L
④有机溶剂
甲醇、甲醛、乙醇、尿素、甲酰胺等
2、变形引起核酸理化性质改变
①紫外吸收增强
增色效应。碱基堆积力降低紫外吸收；变性后力的作用效果削弱，碱基紫外吸收能力充分显现。
②DNA浮力增加
链内互补碱基配对形成更加致密的结构
③降低DNA粘度
刚性结构破坏，粘度下降
④沉降速度加快
构象改变，旋光性改变。
⑤功能是否改变
DNA
有利于生物学功能表达，因为DNA单链储存遗传信息
RNA
mRNA/RNA病毒
变形不改变功能
tRNA、RNA、snRNA、snoRNA 、核酶
变性完全丧失生物活性
Tm
DNA熔点：指DNA双螺旋一半解开/热变性/氢键断裂时的温度（82~95℃）。或增色效应一般是的温度。S型曲线
DNATm值变化因素
1||| DNA均一性
DNA序列均一性
DNA组成均一性
均一性↑，Tm范围↓
2||| GC含量
GC含量↑，Tm↓
ω%(G+C)=2.44(T.-69.3℃)
3||| 离子强度
离子强度↑，DNA的Tm↑
离子强度越↓，Tm越↓，范围越宽
4||| 双螺旋长度
越长，碱基对越多，氢键越多越稳定，力越强，Tm越大
5||| 此外，破坏氢键或水化层，都可导致Tm↓。 DNA结合蛋白质稳定单链结构，Tm↓；稳定双链则Tm↑
RNA的Tm 双链的话与DNA相似，大多双链区域很少，Tm较低，范围较宽
（6） 复性
蛋白质很难复性（力太多结构复杂)
当各种变性因素不存在时,变性时解开的互补单链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象称为复性。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称为退火。也用于描述杂交核酸分子的形成。
伴随着DNA复性的是其浮力密度、沉降速率和紫外吸收的减少以及黏度的增加,其中紫外吸收减少称减色效应。
影响DNA复性的因素
1、温度
T小于Tm（小于25°左右），复性；T→Tm，复性效果越好
2、DNA浓度
浓度越高，DNA分子越多，有利于复性
3、离子强度
离子强度越高，越有利于复性
4、DNA序列的复杂度/均一性
均一性越高，越有利于复性
Cot
用以表示复性速率与DNA序列复杂度的关系。Co为单链DNA的起始浓度,t是以s为单位的时间
复杂度即重复片段的核算数
复性率0.5时的Cot称1/2Cot，与复杂度成正比
（7） 杂交
核酸杂交(nucleic acid hybridization)是一种利用核酸分子的变性和复性的性质,将来源不同的核酸片段,按照碱基互补配对规则形成异源双链(heteroduplex),进而对特定目标核酸进行定性或定量分析的技术。
Southem 印迹、Northem 印迹和 DNA 芯片
（8） 核酸水解
1||| 酸水解
酸敏感性：糖苷键>磷酸酯键;嘌吟糖苷键>嘧啶糖苷键
2||| 碱水解
RNA特别是mRNA内的磷酸二之脂键碱特别敏感，有2‘-OH，碱性下去质子化，O亲核进攻P，形成2’-或3‘-核苷酸混合物
3||| 酶水解
底物特异
DNA酶（DNase)
RNA酶 (RNase)
磷酸二酯酶，水解DNA和RNA
作用方式
内切核酸酶
外切核酸酶
磷酸二酯键断裂方式
5’-核苷酸水解酶
3‘-核苷酸水解酶
常见
①核糖核酸酶H→专门水解DNA/RNA杂交链
②核糖核酸酶S→专门水解单链核酸
③限制性内切酶→水解有专门的识别位点的酶（EcoR1等）
肽核酸（PNA）
肽键（异肽键）替代磷酸二酯键，仍是碱基互补。
不被天然核酸酶或蛋白酶降解，极稳定
作用：代替天然的DNA,作为一种工具,被广泛用于生化、遗传和医学等领域。为分子杂交技术的探针对靶核酸实施检测
核酸的研究技术和方法
一、核酸的化学合成
PCR引物、测序引物、DNA 芯片、基因工程、DNA探针、核酸适体、干扰 RNA 等都需要使用化学的方法合成长短不一的核酸
好处:不受序列和结构的限制,在合成中可直接引入修饰的碱基、修饰的戊糖或修饰的戊糖-磷酸骨架,从而提高特异性、碱基配对的稳定性。甚至还能产生新的功能。核酸的化学合成与多肽的化学合成在原理上基本相似
步骤：起始原料的制备、偶联反应、去保护
二、核酸的分离、纯化和定量
(一)核酸的抽取
(1)两种核蛋白的分离
分段盐析分离
脱氧核蛋白在 0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度很低,在1mol/L的NaC溶液中很高,而核糖核蛋白在 0.14mol/L的NaCl 溶液中的溶解度较高。 因此,常用 0.14 mol/L和1 mol/L-NaCl溶液分别抽取核糖核蛋白和脱氧核蛋白
(2)蛋白质的去除
蛋白酶K的消化/氯仿的抽取 DNA于上层
(3）核酸沉淀
冷无水乙醇＋盐浓度
(二）电泳
琼脂糖凝胶电泳
分离大分子
可用溴乙锭EB染色（EB很小，插入碱基对间，荧光检测）
聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离分子量小的物质
(三）离心
CsCl密度梯度离心
ρRNA＞ρDNA＞ρ蛋白质
RNA在底部、DNA中部、蛋白质上方
(四）层析
阴离子交换层析
寡聚 dT亲和层析分离带有多聚腺苷酸尾的真核生物 mRNA
(五)核酸纯度检测和定量
紫外分光光度法OD260
DNA：2＞OD260＞1.8，纯；＜1.8则蛋白质污染
RNA：2.0＞OD260＞1.9
三、核算一级结构测定
难点
①四种核苷酸位点少
②长度远大于蛋白质
改革进步
①发现许多限制性内切酶（RE）特意切割核苷酸序列
②聚丙烯凝胶电泳技术发展，可分离很小的片段，精度很高
步骤
①将DNA用RE切成若干小片段，PAGE电泳分离，分别测序
第一代DNA测序-双脱氧法
②利用不同的RE选择不同切点，重复①
③利用片段重叠法推测DNA序列
