重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品申报上市药学共性问题与

这是一篇关于重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品申报上市药学共性问题与的思维导图，主要内容包括：概述，常见问题。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品 申报上市药学共性问题与解答

• 概述
  • 优势：理化性质稳定，致病性、整合风险低，外源基因表达持久
  • 挑战：生产工艺路线复杂，质量研究和控制也存在诸多难点
  • 目的：对rAAV产品工艺和质量相关共性问题的监管考虑，完善内容
• 常见问题
  • 外源病毒因子风险控制策略
    • 问题：针对rAAV产品不同生产工艺开展外源病毒因子检测和控制的要求？
      • 分类
        • 辅助病毒非依赖性产品
          • 使用瞬时转染的细胞系
          • 使用稳定转化的细胞系
          • 通过重组杆状病毒等生产的rAAV产品
        • 辅助病毒依赖性产品
          • 生产工艺中需要使用辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）
      • 控制策略
        • 瞬时转染细胞系或稳定转化细胞系生产的rAAV产品
          • 污染源
            • 细胞系，生产过程中使用的动物/人源材料
          • 策略
            • 1. 按照ICH、《中国药典》等相关技术指南要求对主细胞库、工作细胞库、体外限传代次细胞进行全面检定，结合细胞来源、传代或改造历史、建库过程中使用的原材料情况等进行风险评估后确定外源病毒因子检测种类
            • 2. 对动物/人源材料，应结合其来源、生产工艺等开展特异性外源病毒检测，病毒检测种类应全面反映可能引入的外源病毒，检测方法应能有效检出特异性外源病毒
            • 3. 在适宜的生产步骤进行外源病毒的检测，作为工艺过程控制项目并设立合理的验收标准，通常选择的样品是未处理的病毒收获液
            • 4. 如果在细胞库检定和未处理的病毒收获液中未发现除目标重组腺相关病毒产品以外的其他病毒、病毒样颗粒（Virus-like particles, VLP）或逆转录病毒样颗粒（Retrovirus-like particle, RVLP），则建议使用非特异“模型”病毒开展病毒去除/灭活验证，以评估现有生产工艺步骤对非特异性“模型”病毒的清除能力
            • 5. 外源病毒因子污染风险可控，则无需评估每个剂量中病毒颗粒量，也无需对原液/纯化后产品进行外源病毒检测
        • 采用杆状病毒-昆虫细胞系生产的rAAV产品
          • 污染源
            • 包装/生产用细胞以及病毒种子批，生产过程中使用的动物/人源材料
          • 策略
            • 1. 包装/生产用细胞、动物/人源材料外源病毒的控制在参见瞬时转染细胞系或稳定转化细胞系生产的rAAV产品 “a-b”所述要求的基础上，还应考虑对昆虫细胞库增加弹状病毒、螺原体等项目的检定
            • 2. 病毒种子批的检定项目应符合《中国药典》或其他通行技术指导原则的相关要求，并根据病毒种子批建立的特定情况，以及对病毒种子相关特征的评估设定相应的检定项目。由于重组杆状病毒本身可能对外源病毒因子传统检测方法（体外法、体内法）产生干扰，建议对病毒种子中和后再进行检测，如不能被充分中和，可在生产中设置对照细胞，采用对照细胞进行外源病毒因子检测
            • 3. 建议在适宜的生产步骤进行外源病毒的检测，作为工艺过程控制项目并设立合理的验收标准。检测样品一般建议采用未处理的病毒收获液，其检测要求同病毒种子批，应在上市阶段提供至少3批次未处理病毒收获液的杆状病毒和弹状病毒定量检测结果，用于评估生产工艺对上述病毒的清除率
            • 4. 由于包装/生产用细胞中可能含有弹状病毒，并且生产体系中引入了重组杆状病毒，因此，应考虑在生产工艺中设立病毒去除/灭活单元，并参考ICH Q5A的一般原则开展病毒去除/灭活验证研究
            • 5. 对于原液/纯化后产品的外源病毒检测和控制，如果基于a-c全面检测和控制，以及d已证明工艺步骤对相关病毒或特异性“模型”病毒具有稳健的清除能力和效果，上市申请时，应提供至少3批次中试规模或商业化生产规模原液/纯化后产品的残留重组杆状病毒和弹状病毒检测结果的代表性数据，检测方法应选择特异性和灵敏度较高的合适方法
        • 采用腺病毒、单纯疱疹病毒等辅助病毒生产的rAAV产品
          • 污染源
            • 包装/生产用细胞以及病毒种子批，生产过程中使用的动物/人源材料
          • 策略
            • 1. 包装/生产用细胞、动物/人源材料外源病毒的控制参见瞬时转染细胞系或稳定转化细胞系生产的rAAV产品 “a-b”所述要求
            • 2. 病毒种子批的检定项目应符合《中国药典》或其他通行技术指导原则的相关要求，并根据病毒种子批建立的特定情况，以及对病毒种子相关特征的评估设定相应的检定项目。由于辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）本身可能对外源病毒因子传统检测方法（体外法、体内法）产生干扰，建议对病毒种子中和后再进行检测，如不能被充分中和，可在生产中设置对照细胞，采用对照细胞进行外源病毒因子检测
            • 3. 在适宜的生产步骤进行外源病毒的检测，作为工艺过程控制项目并设立合理的验收标准。检测样品一般建议采用未处理的病毒收获液，其检测要求同病毒种子批。同时，应在上市阶段提供至少3批次未处理病毒收获液的辅助病毒定量检测结果，用于评估生产工艺对辅助病毒的清除率
            • 4. 由于生产过程中使用了辅助病毒，因此，应考虑在生产工艺中设立病毒去除/灭活单元，并参考ICH Q5A的一般原则开展病毒去除/灭活验证研究。原则上，病毒清除验证研究应使用已鉴定的病毒，如果不能使用已鉴定的病毒，则应使用“相关”病毒或特异性“模型”病毒开展研究
            • 5. 对于原液/纯化后产品的外源病毒检测和控制，如果基于a-c全面检测和控制，以及d已证明工艺步骤对相关病毒或特异性模型病毒有稳健的清除能力和效果，则建议上市申请时，应提供至少3批次中试规模或商业化生产规模原液/纯化后产品的残留辅助病毒检测结果的代表性数据，检测方法应选择特异性高和灵敏度高的合适方法
  • 纯度检测方法选择和标准限度制定的一般考虑
    • rAAV产品纯度检测时，对使用CE-SDS方法或SDS-PAGE方法选择的一般考虑
      • 原理:基于在变性条件下蛋白与SDS结合形成带负电的蛋白质-SDS复合物，这些复合物在电场作用下根据分子量大小进行分离，是目前蛋白质纯度检测比较常见的方法
      • 鼓励优先采用灵敏度和准确度较高的检测方法用于产品纯度检测
    • rAAV产品单体和聚集体含量是否必须纳入质量标准？
      • 建议尽可能采用多种技术手段或方法对产品开展全面的表征研究，反映生产工艺的稳健性和产品质量特性
    • rAAV产品特征性衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3）控制策略的一般考虑
      • 特点：rAAV产品，VP1、VP2、VP3含量差异较大，通常VP1和VP2含量较低，VP3含量较高
      • 要点：结合产品特点、分子设计、受工艺影响的程度以及对安全性、有效性、质量可控性的影响程度综合考虑。
  • 基因组滴度检测方法选择和不同方法桥接对比研究的一般考虑
    • rAAV产品基因组滴度检测时，使用qPCR方法或d(d)PCR方法选择的一般考虑
      • 鼓励优先采用灵敏度和准确度较高的检测方法用于产品基因组滴度检测
    • qPCR方法和d(d)PCR方法检测结果存在的差异？如何进行桥接和结果校准
      • 开展必要的变更后方法的全面验证并对变更前后方法进行桥接研究，应确保变更后方法对产品质量的控制能力与变更前方法相当或更优
  • 空壳率检测方法选择和标准限度制定的一般考虑
    • 目前rAAV产品常见的空壳率检测方法包括AUC方法、IE-HPLC方法、SEC-MALS方法等，对于不同检测方法作为表征研究或质量标准的一般考虑
      • AUC法对完整包装病毒、部分包装病毒和空壳病毒的分离效果方面较好
    • 对于rAAV产品空壳率标准限度制定的一般考虑
      • 对于空壳率标准限度的拟定，建议基于产品特点、生产工艺和既往历史批次检测数据、给药方式和剂量，以及与临床安全性和有效性的相关性等因素综合考虑
  • 效价检测方法的一般考虑
    • 特点：效价作为反映产品生物学活性的关键质量属性，不仅包括检测产品本身的效价，如感染滴度，还应考虑其递送基因表达产物的效价，如表达产物的生物学活性。
    • 早期临床试验阶段，建议根据产品设计和对产品作用机制的理解，初步建立生物学活性分析方法
    • 中期临床试验不断推进，建议持续完善效价相关的关键质量属性的确认和效价控制策略，并尽可能建立关键质量属性与效价之间的相关性
    • 采用生物学测定方法作为效价检测方法可能受多种因素影响，比如不同仪器之间变异性影响，不同分析人员变异性影响，以及生物学测定方法中使用的检定用细胞、生物试剂等变异性影响。因此，建议尽可能识别可能影响效价检测方法的潜在影响因素，并充分评估这些因素对方法准确度、精密度等影响
  • 可复制型腺病毒（Replication Competent AAV, rcAAV）检测方法和标准限度制定的一般考虑
    • rcAAV检测方法选择的考虑？
      • 定义：由于载体基因组、Rep/Cap基因以及ITR序列可能发生同源和/或非同源重组，可能会形成具有复制能力和潜在感染性的野生型病毒，即复制型腺相关病毒
      • 影响：rcAAV在辅助病毒（例如腺病毒Ad5）存在条件下可以复制扩增，可能影响转基因表达或诱导机体产生免疫反应，是一种具有潜在风险的工艺相关杂质
      • 建议采用细胞培养法与PCR相结合的方法
    • rcAAV检测方法中阳性病毒选择的考虑？
      • 建议选择与产品血清型一致的阳性病毒作为对照病毒
      • 在申报资料中提供阳性病毒的来源、制备工艺、主要功能元件及感染滴度标定的详细资料，并关注阳性病毒在贮存期间的滴度稳定性
    • rcAAV检测方法中共培养细胞选择的考虑？
      • 考虑到不同血清型病毒对不同细胞的感染特性或感染能力不同，鼓励尽可能基于产品特性筛选易感的细胞系
      • 共培养细胞应按照《中国药典》检定用细胞相关要求提供全面的研究资料
    • rcAAV标准限度如何制定
      • rcAAV标准限度应在上市阶段结合方法验证结果、批次数据积累、临床安全性和有效性等情况设定合理的标准限度
  • 残留DNA片段大小控制要求
    • rAAV产品中残留DNA大小分布是否需要纳入质量标准
      • 建议在临床试验阶段对DNA片段大小进行持续监测，积累多个批次数据，并关注不同DNA片段大小分布变化情况，基于积累的数据和安全性评估情况综合考虑，可不强制要求纳入质量标准
    • rAAV产品中残留DNA片段大小达不到现有指导原则＜200bp要求，如何考虑
      • 开展更加充分的研究和安全性评估数据证明残留DNA片段大小内控标准限度拟定的合理性
      • 基于提高产品质量，降低潜在安全性风险工艺相关杂质水平的考虑，鼓励申请人通过不断优化生产工艺尽可能降低>200bp残留DNA片段的比例