基因工程

生物技术概论，展示了基因工程在转基因生物研究中的关键技术、基因元件及其作用机制，有助于理解基因工程的基本原理和应用方法。

基因工程

• 转基因植物
  • 标记基因
    • 新霉素磷酸转移酶基因
      • 原理：对非转化细胞：新霉素（氨基糖苷类抗生素）能与细菌核糖体30S小亚基结合，抑制蛋白质合成（杀细菌），也能抑制植物线粒体和叶绿体蛋白质合成（杀双子叶植物）
      • 对转化细胞：新霉素磷酸转移酶基因（neo）可以磷酸化氨基糖苷类抗生素，从而使其失活
    • bar基因
      • 原理：对草（没导）：除草剂膦丝菌素可抑制谷氨酰胺合成酶活性，使草大量积累氨而中毒致死
      • 对植物（导了）：bar基因编码膦丝菌素乙酰转移酶，能使乙酰转移酶失活
  • 报告基因
    • 绿色荧光蛋白基因
      • 酵母双杂交
        • 目的：用已知蛋白质找到与之互作的未知蛋白
        • 原理：转录激活蛋白有两个结构域：DNA结合结构域和激活结构域，两者结合才能使报告基因表达
        • 步奏： 构载体：将已知蛋白X基因与DNA-BD基因融合构造BD-X表达载体（诱饵蛋白），未知蛋白Y基因与AD基因融合构造AD-X表达载体（猎物蛋白） 导细胞：将载体导入携带报告基因的酵母细胞 检验：X-BD蛋白结合在报告基因上，若X与Y互作，则AD与BD靠的很近，可以转录报告基因，反之则反
  • 外源基因在植株中的表达
    • 构建高效表达载体
      • 强启动子
        • 组成型启动子
          • 双子叶植物：花椰菜花叶病毒CAMV35S启动子
          • 单子叶植物：水稻肌动蛋白基因启动子Act1和玉米泛素基因启动子Ubi
        • 诱导型启动子
          • A型
            • 对植物激素做出反应
          • B型
            • 环境物理化学因素
          • C型
            • 人工合成的化合物
      • 终止子
        • CAMV35S终止子，nos终止子
      • 对调节序列和基因适当改造
        • 同一启动子重复串联、不同启动子融合、高表达外显子和内含子、转基因植物偏爱的密码子
    • 克服基因沉默
      • 原因：①外源基因随机整合到甲基化区或异染色质区 ②外源基因成串多拷贝，其转录RNA回折形成互补双链RNA
      • 方法
        • 在外源基因两端插入MAR区（基质附着区：一段与核蛋白基质特异结合的DNA序列），当MAR与核基质结合时形成突环，从而阻止邻近DNA序列对基因表达的影响
• 转基因动物
  • 标记基因
    • 胸苷激酶（TK）基因
      • 原理：TK催化胸苷转化为胸苷酸（补救途径）
      • 细胞培养在5-溴尿嘧啶脱氧核苷（BUdR）培养基中 有TK基因的（没导的）：BUdR作为胸苷类似物转化为胸苷酸并掺入细胞DNA中，导致DNA复制错误，用紫外线照射可杀死 而TK失活的表型（导了）：可存活下来
    • 二氢叶酸还原酶基因
      • 原理：氨甲蝶呤（MTX）能抑制二氢叶酸还原酶
      • 携带抗MTX基因的能存活
    • 氯霉素乙酰基转移酶（CAT）基因
      • 原理：此酶能转移乙酰辅酶A的乙酰基到氯霉素上面，使氯霉素（抑制肽酰转移酶活性，从而抑制蛋白合成）失活
    • 黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因
      • 补救途径
    • 氨基糖苷磷酸转移酶基因
      • 同植物新霉素
  • 基因编辑
    • 基因敲除（DNA水平）
      • 外源基因与靶基因同源重组，从而使靶基因失活或敲除
    • 基因沉默（RNA干扰）
    • 基因编辑
      • 三种特异切割基因的核酸酶
        • ZnF（锌指核酸酶）
          • 原理：由锌指蛋白和核酸酶融合而成
          • 锌指结构域是DNA结合蛋白，而锌指核酸酶有核酸酶活性 构建ZNF表达载体导入细胞，然后借助细胞双链断口修复机制使末端连接。
        • TALEN（转录激活因子样效应物核酸酶）
          • 用TAL效应子取代锌指，核酸酶不变
          • TAL效应子识别能力极强
        • CRISPER-Cas（成簇规则分散短回文序列-cas系统）
          • 是依赖RNA对DNA序列的识别，有更高的识别能力
          • 外源基因切割并插入：外源DNA入侵时，细菌将其切割成小片段并插入CRISPER的间隔区，并转录成pre-crRNA CRISPER转录并加工：Pre-crRNA与tracrRNA结合形成成熟的crRNA（指导RNA） Cas9的结合与DNA切割：Cas9与crRNA结合，然后在crRNA的指导识别下，Cas9切割DNA互补链