细胞生物学研究方法

这是一篇关于细胞生物学研究方法的思维导图，主要包含：细胞形态结构的观察方法、细胞及其组分的分析方法、细胞培养&细胞工程、细胞及生物大分子的动态变化等详细知识点。

细胞生物学研究方法

• 细胞形态结构的观察方法
  • 光学显微镜
    • 原理
      • use the refrection of light rays to magnify an object.
    • 组成
      • condenser
        • 聚光镜 directs light toward the specimen
      • 光源、滤光片
      • 照明系统
      • objective lens
        • 物镜 collects light from the speciman
      • ocular lens
        • 目镜 forms an enlarged,virtual image
      • 光学放大系统
    • 分类
      • Bright-Field Light Microscopy
        • 特点
          • 背景明亮
          • high contrast
        • 适用范围
          • 高对比度
          • stained section of tissues
        • 标本制备
      • Dark-Field Light Microscopy
        • 特点
          • 光阑 a spot between the light source and the condensing lens
          • 背景黑暗&标本边缘发亮
          • relution 50X bigger than light/observe 4~200nm particles
        • 适用范围
          • 观察物体的边缘、‌轮廓、‌边界和折射率梯度
          • 微笑水生生物、硅藻、小昆虫
      • Phase-Contrast Microscopy
        • 特点
          • converting differences in the refractive index(折射率)of some parts of the specimen into differences in light intensity(光强)
          • small phase shifts(相位差)in the light passing through a transparent specimen are converted into amplitude changes(振幅差)in the image.
        • 适用范围
          • 适合去观察活细胞
        • 组成
          • Phase-Ring 相差板
          • Attennuate the light 环状光阑
      • Differential interference contrast optics
        • 微分干涉显微镜（DIC）
          • 更适合于研究活细胞
          • 分辨率比普通光镜提高一个数量级，可以用来直接观察颗粒物质沿着微管运输的动态过程
        • 原理
          • the rate of change of refractive index across a specimen
          • 光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品相邻部位，在经过令一棱镜将两束光会和。把样品厚度上的微笑区别转化成明暗区别。
      • Fluorescence microscope
        • 核心部件
          • 滤光片系统
            • 激发滤光片
              • 安装在光源和样品之间，允许特定激发光通过
            • 阻断滤光片
              • 安装在物镜和目镜之间，允许荧光染料荧光通过
          • 装用物镜镜头
        • 标记技术
          • 免疫荧光技术
            • Fluorochrome-conjugated antibodies 荧光染料偶联抗体
            • GFP
          • 荧光素直接标记技术
            • DAPI与DNA特异性结合
        • 应用
          • 对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究
        • 激发光波长比荧光波长短
          • 特点
      • Laser scanning confocal microscope （LSCM）
        • 原理
          • 聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上
        • 核心部件
          • pinhole aperture
            • 针孔光阑
          • illuminating pinhole
            • 照明针孔
          • 共聚焦
        • 应用
          • 亚细胞结构、组分的定位、动态变化
        • 特点
          • The resolution is 1.4~1.7 times higher than normal fluorescence microscope
          • 只聚焦在一个点上
  • Electron Microscopy(EM)电子显微镜
    • 基本知识
      • 与光学显微镜的区别
      • 电子显微镜基本构造
        • 电子束照明系统
          • 电子枪
            • 高压高温使钨丝产生电子束
          • 聚光镜
        • 成像系统
          • 物镜
          • 中间镜
          • 投影镜
          • 改变线圈的电流大小，调节圆柱体内空间的磁场强度
        • 真空系统
          • 真空泵
            • 利于电子运动
        • 记录系统
          • 荧光屏或CCD
    • 电镜制样技术
      • 超薄切片技术
        • 原理
          • 为获得较高分辨率，切片厚度为40~50nm，样品有刚性且有韧性
        • 步骤
          • 固定
            • 要求
              • 样品形态和精细结构不发生改变
              • 细胞内部成分保持在原来的位置，不发生改变
            • 方法
              • 化学法
                • 戊二醛&四氧化俄
              • 物理法
                • 超低温冷冻
          • 包埋
            • 目的
              • 在切片过程中，包埋介质能均匀良好的支撑样品以便获得连续完整有足够支撑强度的超薄切片
            • 步骤
              • 脱水
              • 包埋剂填充
                • 环氧树脂
          • 切片
            • 工具
              • 玻璃刀
              • 钻石刀
            • 切完后在负有支持膜的载网（铜网、镍网）
          • 染色
            • 原理
              • 重金属盐对电镜样品染色
              • 电子束穿过样品，金属离子不同程度地散射和吸收电子，在样品图像上显示出明暗差别
            • 染料
              • 锇酸
                • 脂质
              • 柠檬酸铅
                • 蛋白质
              • 乙酸双氧铀
                • 核酸
      • 负染色技术
        • 方法原理
          • 重金属盐对载网上的样品进行染色，吸去多余染料，待样品自然干燥
        • 染料
          • 磷钨酸
          • 醋酸双氧铀
        • 适用范围
          • 纯化的细胞组分或结构
      • 冷冻蚀刻技术
        • 步骤
          • 冰冻断裂
            • freeze-fracture replication
          • 蚀刻复形
            • heavy-metal layer is deposited on fractured surface
        • 优势
          • 观察膜断裂面上的蛋白颗粒和膜表面形貌特征，图像更有立体感
          • 样品无需包埋，更好保持样品真实结构
        • 应用
          • 观察细胞质中的细胞骨架纤维及其结合蛋白
      • 电镜三位重构与低温电镜技术
        • 原理
          • 利用穿透样品的电子成像
        • 应用
          • 低温电镜单颗粒分析技术
          • 大尺度的细胞器、细胞骨架、膜泡运输系统的三维研究
        • 制样
          • 在冷冻剂中速冻
          • 在-160摄氏度利用相位衬度成像
      • 扫描电镜技术
        • 原理
          • 电子枪发射的电子束在磁场作用下汇聚形成极细探针对样品进行扫描
        • 制样
          • 二氧化碳临界点干燥法
  • 扫描隧道显微镜（STM）
    • 原理
      • 量子力学中的隧道效应
    • 特点
      • 具有原子尺度的高分辨本领
        • 0.1~0.2nm
      • 可以在真空、大气、液体接近于生理环境中工作
      • 非破坏性测量
• 细胞及其组分的分析方法
  • 用超离心技术分离细胞组分
    • 差速离心
      • 利用不同离心速度产生不同的离心力把质量和密度不同的亚细胞和各种组分分离开
    • 密度梯度离心
      • 将分离的细胞组分铺放在密度逐渐增加的、高溶解性的惰性物质形成的密度梯度溶液表面，通过重力或离心力作用使不同组分以不同的沉降率沉降
      • 分类
        • 速度沉降
          • 原理
            • 细胞组分根据不同大小速度沉降
          • 应用
            • 密度相近而大小不一的细胞组分
        • 等密度沉降
          • 原理
            • 细胞组分在连续梯度的高密度介质中经离心力长时间的作用沉降到与自身密度相等的位置
          • 应用
            • 分离不同密度的细胞组分
  • 特异性蛋白抗原的定位与定性
    • 免疫荧光技术
      • 原理
        • 将免疫学方法与荧光标记技术相结合用于研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法
      • 方法分类
        • 直接免疫荧光技术
        • 间接免疫荧光技术
      • 制备步骤
        • 荧光抗体制备
        • 标本处理
          • 目的
            • 尽量完好地保持被检测蛋白质的抗原性
          • 方法分类
            • 组织切片
            • 冷冻切片
            • 整装细胞
        • 免疫染色
        • 观察记录
      • 弊端
        • 分辨率有限
      • 优势
        • 快速、灵敏、特异性强
    • 免疫电子显微技术
      • 分类
        • 免疫铁蛋白技术
        • 免疫酶标技术
        • 免疫胶体金技术
        • 与抗体结合的标志物不同
      • 制备步骤
        • 固定
        • 包埋
        • 超薄切片
        • 免疫标记
        • 染色
  • 细胞内特异核酸的定位与定性
    • 细胞内特异核酸的定性与定位的研究
    • in situ hybridization (原位杂交)
      • 用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异性核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法
  • 细胞成分的分析与细胞分选技术
    • flow cytometry (流式细胞术)
• 细胞培养&细胞工程
  • 细胞培养
    • 植物细胞培养
      • 细胞培养
        • 花药-胚状体-单倍体
      • 原生质体培养
        • 原生质体
          • 纤维素酶处理去掉细胞壁，去壁的细胞
    • 动物细胞培养
      • 体外培养的细胞分类
        • primary culture cell
          • 从机体取出后立即培养的细胞
        • subculture cell
          • 适应体外条件，进行持续传代培养的细胞
      • 体外培养细胞基本形态分类
        • 成纤维样细胞
        • 上皮样细胞
      • 培养方法
        • 贴壁培养
        • 单层细胞培养
          • 单层细胞
          • 分散呈圆球形的细胞一经贴壁就迅速铺展开并开始有丝分裂，逐渐形成致密的细胞单层
        • 悬浮培养
      • cell line 细胞系
        • 定义
          • 可顺利传代40-50次且仍保留原来染色体二倍体数量及接触抑制的行为的传代细胞
        • 分类
          • finite cell line
            • 传代次数有限的体外细胞培养
          • infinite cell line
            • 细胞发生遗传突变，使其带有癌细胞的特点，可能在培养条件下无限制地传代培养下去
  • 细胞工程
    • 细胞融合( cell fusion )和单克隆抗体技术(Monoclonal Antibody)34
      • syncytium(多核体)
        • homokaryon 单核体
          • A syncytium come from uninuclear with the same gene
        • heterokaryon 异核体
          • A syncytium come from uninuclear with different gene
    • 显微操作技术(Micromanipulation)与动物克隆技术35
• 模式生物&功能基因组的研究
• 细胞及生物大分子的动态变化
  • （FRAP）荧光漂白恢复技术
    • 原理
      • 利用高能激光束照射细胞某一特定区域,使该区域内标记的荧光分子发生不可逆的淬灭，为光漂白区（photobleaching）
      • 细胞中脂质分子或蛋白质分子运动，周围非漂白区的荧光分子不断向光漂白区迁移，使光漂白区的荧光强度恢复到原有水平，为荧光恢复（fluorescence recovery）
    • 应用
      • 荧光恢复速度很大程度反应荧光标记的脂质或蛋白质在细胞中运动速率
      • 活细胞内脂质和蛋白质运动速率的定性定量分析
  • （yeast two-hybrid system）酵母双杂交技术
    • 原理
      • DNA结合域
        • 可识别DNA上的特异转录调控序列并与之结合
      • 转录激活域
        • 与其他成分作用形成转录复合体，启动它调节的基因转录
    • 应用
      • 蛋白-蛋白相互作用
  • （fluorescence resonance energy transfer,FRET）荧光共振能量转移技术
    • 应用
      • 检测活细胞内两种蛋白质
    • 原理
      • 有一定波长激发光照射下，只有携带基团A的供体分子可以激发出荧光A，但基团B受体分子不能激发出荧光B。
      • 供体基团发出的荧光光谱与吸收光谱相互重叠，并且两个发光基团之间距离小到一定程度，会发生不同程度能量转移。
      • 分子距离在10nm之内，发生FRET现象，则认为两个蛋白存在直接相互作用。
      • 共振能量转移效率很大程度上反映了细胞内两种蛋白相互作用的可能性与作用的强弱。
  • （autoradiography）放射自显影技术
    • 原理
      • 利用放射性同位素的电离射线对乳胶（含AgBr/AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术
    • 步骤
      • 同位素标记的生物大分子前体参入
      • 细胞内同位素所在位置的显示
    • 优势
      • 对细胞或生物体内生物大分子进行动态研究和追踪（pulse-chase）