氨基酸、肽和蛋白质

描述了氨基酸的分类、物理和化学性质、分离方法；肽；蛋白质的组成、结构、测序方法等，结构清晰，层次分明，对相关知识进行了系统梳理。

生物化学第二章

• 氨基酸、肽和蛋白质
  • 氨基酸——蛋白质的单体亚基
    • aa（AA）是蛋白质的基本结构单位
    • 蛋白质水解
      • 按蛋白质水解程度
        • 完全水解：aa混合物
        • 部分水解：肽段和aa
      • 水解方法 讲义P9
        • 酸/碱/酶 水解
          • 酸水解破坏 天冬/谷氨 酰胺 ，苏/丝/酪/色 氨酸 碱水解可回收色氨酸
    • a一氨基酸通式 （均为L一氨基酸）
      • 脯氨酸（N3H+→NH） 因此不和茚三酮反应
    • aa的制备方法
      • 水解蛋白质 酸/碱/酶 水解 人工合成法 外消旋物 微生物发酵法 eg谷氨酸
  • aa的分类
    • 蛋白质aa
      • 常见aa （基本aa）
        • 均为L一氨基酸，除甘氨酸外
        • 分类
          • 按侧链结构分
            • 芳香族
              • 色氨酸
              • 酪氨酸
                • 酪氨酸在奶酪中含量丰富
              • 苯丙氨酸
                • 苯丙氨酸浓度测定被用于苯丙酮尿症的诊断（考过）
            • 杂环
              • 色氨酸：在植物和某些动物体转化成泛酸，有时归入芳香族。 组氨酸：碱性氨基酸，大量存在于珠蛋白，某些酶活性部位的催化基团。
              • 脯氨酸
                • 无自由α-氨基，在肽链转角处丰富
            • 脂肪族
              • 中性aa
                • 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸
              • 极性aa
                • 含OH
                  • 丝氨酸
                    • 丝蛋白中得到，酪蛋白、卵黄磷脂蛋白以磷酯酸形式存在，酶催化和调节作用中发挥作用
                  • 苏氨酸
                    • 发现最晚的一种氨基酸
                • 含SH
                  • 半胱氨酸
                    • 多以胱氨酸形式存在， 可形成分子内或分子间二硫键，维持蛋白质高级结构的作用力，对蛋白质高级结构形成具重要作用
                    • 某些酶的活性基团
                • 含CONH
                  • 天冬酰氨、谷氨酰氨
                    • 参与氨代谢，植物体内重要的氨的转运者
              • 酸性
                • 天冬酰氨、谷氨酸
                  • 参与氨代谢，植物体内重要的氨的转运者
                  • 谷氨酸某些酶的活性基团
              • 碱性
                • 赖氨酸、组氨酸
                • 精氨酸
                  • 蛋白质代谢中尿素形成的中间产物
          • 按R基与水的关系
            • 非极性
            • 极性
              • 不带电
              • 带电
                • 带正电
                • 带负电
          • 按aa是否能在人体中合成
            • 必需aa
              • （His，Ile，Leu，Lys，Met, Phe, Thr, Trp，Val）
                • 笨（苯丙氨酸）蛋（蛋氨酸）来（赖氨酸）宿（苏氨酸）舍（色氨酸），晾（亮氨酸）一晾（异亮氨酸）足（组氨酸）球鞋（缬氨酸）
              • His（主），Arg对于婴幼儿而言是必须的
            • 非必需aa 半必需aa
        • 结构特点
      • 不常见aa
        • 焦谷氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、3-甲基-组氨酸，N-甲基精氨酸、Y-羧基谷氨酸、4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、 &-甲基赖氨酸、 ε-N，N,N-三甲基赖氨酸和N-乙酰赖氨酸等。
          • 取代基/磷酸+常见aa
        • 由已加入多肽链aa残基（常见aa）修饰而来
    • 非蛋白质aa
      • 肌氨酸、环丝氨酸、高半胱氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸等
  • 性质
    • 物理性质
      • 构型
        • 除甘氨酸以外，可以发生消旋作用，即D、L互变； Thr 和Ile有2个C*，存在四种光学异构体
        • 特殊
          • 胱氨酸
            • 2个C*相同时，有D/L型 2个C*不同时，无D/L型即内消旋
      • 旋光性
        • 均有（±） 比旋光度α-氨基酸特征的物理常数
          • 甘氨酸无C*，即无D/L构型，但有（±）
      • 光谱性质
        • 在近紫外区只有芳香族aa有吸光能力 在280nm测定样品中蛋白质含量
          • 紫外光区苯丙氨酸（257m），酪氨酸（275nm)，和色氨酸（280nm）有紫外吸收
          • 氨基酸是在280 nm处有最大吸收峰，核酸是260 nm，肽键是215nm
    • 酸碱性质（两性解离）
      • 氨基酸的等电点PI
        • 静电荷为0时的pH
        • pI-pH: 负数，带负电，在电场中向正极移动 正数，带正电，在电场中向负极移动 （化学式辅助理解，不用记）
          • pI只取决于等电点两侧离子pKa，不受pH的影响
          • 考法
            • 电泳→正极，即需带负电，pH>pI →负极，即需带正电，pH<pI →不移动，两性离子，即所带电荷=0，pH=pI，溶解度最小（min）
      • 第一，20种基本氨基酸，除组氨酸外，在生理pH（7左右）溶液中都没有明显的缓冲能力，组氨酸咪唑基的pKa为6.0在pH7附近有明显的缓冲作用。 第二，红细胞中的血红蛋白含有较多的组氨酸残基，使得它在pH左右的血液中具有显著的缓冲能力，使得红细胞在血液中起运输O2和CO2
        • 组氨酸有咪唑基→生理pH内缓冲能力最大→多种酶的活性
          • 考法
            • 哪种aa的生理pH内缓冲能力？
            • 酶的活性中心处，为何有组氨酸残基（咪唑基）？
  • aa化学反应 活页本
    • α-羧基参与反应
      • 成盐和成酯反应
        • 氨基酸在盐酸气体的条件下与无水乙醇作用即产生氨基酸的乙酯。羧基在变成甲酯、乙酯或成盐后羧基的化学反应即能被掩盖（羧基保护）
      • 成酰氯反应
        • 氨基酸的氨基加保护基以后，其羧基可以与二氯亚飒或五氯化磷反应生成酰氯。这个反应使羧基活化，使它容易与另一氨基酸的氨基结合是人工合成多肽种常用的反应。
      • 叠氮反应
        • 氨基酸的氨基通过酰化加以保护；羧基经酯化变成甲酯；然后与肼和亚硝酸反应变成叠氮化合物（羧基活化反应）。
      • 脱羧基作用
        • 氨基酸经脱羧酶作用后可以放出二氧化碳生成相应的一级胺
    • α-氨基参与反应
      • 与亚硝酸的反应
      • 氨基酸的甲醛滴定【掌握，知道为何要加甲醛】
        • 通过与甲醛的反应↓氨基的碱性，↑氨基的酸性解离，滴定终点移至pH9附近，用酚酞作指示剂用标准NaOH滴定
      • 与酰化试剂的反应【了解】
        • 氨基酸氨基上氢可以被酰基取代，取代后对氨基有保护作用；苄氧酰氯、丹礦酰氯等
      • 烃基化反应【重点掌握】
        • 2，4一二硝基氟苯（DNFB）
          • 可生成黄色二硝基苯基氨基酸。曾被英国的Sanger 用来鉴定多肽和蛋白质的氨基末端
      • 西佛碱反应
      • 脱氨基反应
        • 氨基酸在体内经氧化酶脱去氨基变成酮酸
    • α-羧基和α-氨基参与反应
      • 与茚三酮反应【掌握】
        • 与茚三酮反应不释放NH3，成黄色→羟脯氨酸，脯氨酸（卖腐的人很黄） 与茚三酮反应释放NH3，成紫色
      • 成肽反应【掌握】
        • 一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基缩合失水形成肽键
    • 侧链官能团参加的反应
      • 讲义P15
  • aa混合物的分析和分离
    • 分配层析
      • 系统组成
        • 固定性（静相）和流动相（动相）
      • 利用混合物在两种不相混溶的液相（流动相和固定相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。
      • 分配系数
        • 当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在流动相和固定相两相内的浓度之比是个常数
      • 物质分配
        • l-l间 g-l间 s-l间
      • 原理——逆流分布
      • 主要种类
        • 逆流分配：纸层析；聚酰胶薄膜层析， 薄层层析
    • 离子交换层析
      • 分类
        • 阴离子交换树脂（如Dawex-1）
          • 在该聚合物上引入带电碱性基团（如-NH3OH），则可解离出0H，溶液中的阴离子能和OH发生交换而挂在树脂上
        • 阳离子交换树脂（如Dwew-50）
          • 在该聚合物上引入带电酸性基团（如-SO3H-COOH），则可解离出H，溶液中的阳离子会和H发生交换而选择性地结合到树脂上，
      • 氨基酸与离子交换树脂的作用力
        • ①静电引力（主）
          • 与氨基酸的解离状态直接相关
        • ②疏水力
          • 在解离状态相近的氨基酸中，侧链疏水性越高，与树脂的作用力越大，在层析柱中停留的时间越长
      • 洗脱顺序
        • H+：酸性＞中性＞碱性aa OH-相反
        • 极性>非极
  • 肽
    • 连接氨基酸残基方式
      • 肽键
        • 是一种酰胺键
      • 二硫键（二硫桥）
        • 2个Cys侧链间形成的二硫键
    • 含2个、3个、4个、5个等氨基酸残基的肽 为二肽（1个肽键）、三肽、四肽、五肽
      • n肽有n个aa残基，n-1个肽键
    • 默认方向N端→C端
    • 肽键共振结果P61
    • 性质
      • 物理性质
        • 不是aa性质的简单加和
        • 短肽是离子晶格，水中是偶极离子存在有一定的旋光性，短肽是各氨基酸的总和
      • 酸碱
        • 决定于游离末端氨基、羧基及侧链可解离的基团，长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链，根据具体条件判断小肽带电性
      • 化学性质
        • 双缩脲反应
          • 肽和蛋白质特有，aa无
          • ≥3肽+碱性CuSO4溶液→紫红色 （≥2肽键）
            • 二肽是不能发生的，因为二肽只有一个肽键
    • 天然存在的活性肽
      • 活性肽
        • 短链且具有生物功能的多肽不算蛋白质
      • 1、激素类：催产素、加压素、舒缓激肽、干扰素、胸腺肽、脑啡肽、睡眠肽等。 2、抗生素：短杆菌肽S、多粘菌素E。 3、剧毒物质：鹅膏草碱（作用于RNA聚合酶Ⅱ）、蝎毒素。 4、谷胱甘肽：谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，红细胞中作为 巯基缓冲剂 维持血红蛋白和其他红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原态。
  • 蛋白质
    • 元素组成
      • C、H、O、N、S其他（P、Fe、Cu、I、Zn、Mo） （碳50-55%，氢6-8%，氧19-24%，氮13-19%，硫0-4%）
    • 蛋白质平均含N量为16%，含量稳定——凯氏定氮法
      • 100克有机物中蛋白质含量=1克样品中N的克数x6.25×100
    • 分类【了解】
      • 按功能
        • 酶、调节/转运/营养储存/收缩/结构/防御 蛋白
      • 按分子组成
        • 单纯蛋白质
          • 按溶解性
            • 清/球/谷/组/鱼精/硬 蛋白
        • 缀合蛋白质
          • 按辅基分
            • 糖蛋白和粘蛋白 核/磷/色/血红素/黄素/金属 蛋白
      • 按形状和溶解度
        • 纤维状蛋白质
          • 不溶于水
        • 球状蛋白质
          • 可溶
        • 膜蛋白（质）
          • 不溶于水但可溶去污剂
    • 分子大小
      • Mr：6000~1X10⁶
        • 上下限人为规定 下限为胰岛素Mr=5733
      • 寡聚蛋白质Mr较大
        • 烟草花叶病毒TMV
      • 分类
        • 单体蛋白质（1条多肽链） 寡聚/多聚 蛋白质（≥2条多肽链）
    • 蛋白质构象
      • 每种蛋白质都有自己特有的空间结构或称三维结构
    • 分子结构的组织层次
      • • aa的一级结构决定它的构象（高级/空间/立体 结构）
    • 功能【了解】
      • 酶、调节/转运/营养储存/收缩/结构/防御 蛋白
    • 一级结构
      • 蛋白质氨基酸（残基）序列决定蛋白质的功能 蛋白质一级结构举例 蛋白质序列数据库
      • 举例
        • 胰岛素
          • 胰岛β细胞分泌的一种激素
          • 前胰岛素原
            • 比胰岛素原多一段肽链（约含2个残基)即信号肽
          • 合成过程
            • 前胰岛素原→胰岛素原→成熟胰岛素
              • 信号肽引生多肽链进入内织网腔后，立即被酶切除，剩余的多肽链折叠成含3个二硫键的胰岛素原。后者进入高尔基体，在酶的催化下除去一段连接胰岛素B链C端和 A链N端的连接肽简称C肽（约含30个残基），转变为成熟的胰岛素。
      • 蛋白质化学测序
        • 前提
          • Mr 纯度＞97%， 蛋白质由几个亚基组成； 测定蛋白质的aa组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量
        • 步骤
          • 1、测定多肽链的数目
          • 2、拆分蛋白质分子得多肽链，并分离纯化每一条多肽链;
            • 非共价，二硫键
          • 3、 断裂链内二硫键
          • 4、测定每一肽链的氨基酸组成：完全水解，计算出氨基酸成分比;
          • 5、 分析多肽N-末端和C-末端
          • 6、裂解多肽链成较小的片段：用两种或几种不同的断裂方式断裂成几套肽段，并分离、纯化肽段；
            • 酶裂解法 化学裂解法 肽段的分离提纯
          • 7、测定各肽段的氨基酸顺序；
          • 8、片段重叠法确定各肽段的顺序；
          • 9、二硫键位置的确定。
        • 举例
          • 胰岛素 核糖核酸酶
  • 蛋白质测序常用方法
    • 末端残基分析
      • N末端 （主）
        • 二硝基氟苯（DNFB/Sanger）法 丹磺酰氯（DNS）法 一一一一一一灵敏度高 氨肽酶法 一 一一一 一一一亮氨酸氨肽酶（常用）
        • 苯异硫氰酸酯（PITC）法 一一一一可重复循环
          • 测定小肽aa最好的方法 （非封闭肽）
      • C末端
        • 羧肽酶法
          • 羧肽酶ABCY
            • A和B来自胰脏
              • A能水解除Pro、Arg 和Lys以外的所有C-末端aa残基 B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键
            • C来自柑桔叶
            • Y来自面包酵母
        • 肼解法
        • 还原法
    • 二硫键的断裂
      • 氧化法
        • 常用试剂：过氧酸
      • 还原法
        • 常用试剂：巯基己醇，尿素
        • or二硫苏糖醇
    • 多肽链的裂解
      • 酶法
        • 糜/胃/嗜热菌 蛋白酶， 羧/氨 肽酶
        • 胰蛋白酶
      • 化学裂解法
        • 溴化氰水解法（CNBr）
          • 只切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键
    • 肽段aa序列的测定
      • Edman化学降解法
        • aa序列的测定
      • 酶降解法 根据核苷酸序列推定法
      • 质谱法
        • 适于小肽的序列测定特别是能测定混合肽的序列 局限是样品必须气化
    • 肽段在原多肽链的次序的确定
    • 原多肽中二硫键位置的确定
      • 胃蛋白酶→对角线电泳
  • aa序列与生物进化
    • 同源蛋白质
      • 当两个基因有着明显的序列相似性（DNA 中的核苷酸序列或其编码的蛋白质中氨基酸序列），则说它们具有序列同源性，或说序列是同源的；它们编码的蛋白质称为同源蛋白质
      • 有相似的功能和三维结构
    • 同源蛋白质aa序列的物种差异
      • 细胞色素C
        • 可变残基（进化位置愈远aa顺序之间的差距愈大） 不变残基（对蛋白质生物学功能维持有重要作用）
      • 系统树
        • 用计算机分析细胞色素C序列建立的
    • 同源蛋白质具有共同的进化起源
      • 氧合血红素蛋白
        • 肌红蛋白与a-珠蛋白，β-珠蛋白
      • 丝氨酸蛋白酶类
        • 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶
        • 是祖先丝氨酸蛋白酶基因复制而来
      • 功能差异大，但三级结构相似
        • 如溶菌酶和a-乳清蛋白，有共同的起源
    • 一级结构的局部断裂与蛋白质激活
      • 如血液凝固时需纤维蛋白原和凝血酶原的变化； 消化液中蛋白水解酶的激活； 多肽和蛋白质激素的前体激活
      • 胰岛素原的激活
        • 前胰岛素原（核糖体上）； 切去信号肽胰岛素原（内质网）； 切去前顺序胰岛素（高尔基器中）肽。
  • 肽和蛋白质的化学合成：固相肽的合成