生物化学第五章：蛋白质的性质，分离纯化和鉴定

主要内容包括：蛋白质在水溶液中的行为，蛋白质分离纯化的一般程序、方法，蛋白质相对分子质量的测定，蛋白质的含量测定和纯度鉴定。

生物化学第五章

• 蛋白质的性质、分离纯化和鉴定
  • 蛋白质在水溶液中的行为
    • 蛋白质的酸碱性质（两性解离）
      • 蛋白分子的可解离基团
        • 末端α-COOH,α-NH2 侧链上的官能团 辅基的可解离基团
      • 两性电解质，多价离子
      • 等电点
        • 带正，负电荷相等，净电荷为0时的pH
        • 酸性aa、碱性aa数目有关
        • 物理性质
          • 导电性、溶解度、粘度、电泳迁移率均最小
            • 制备和沉淀蛋白质
      • 等离子点
        • 没有其他盐类的干扰
        • 等离子点蛋白质特征常数 ≠等电点
    • 蛋白质胶体溶液稳定性因素
      • 水化层，同种电荷
    • 蛋白质的沉淀
      • 盐析法
        • 中性盐（硫酸胺、硫酸钠和氯化钠）使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
      • 有机溶剂沉淀
        • 甲醛、乙醇、丙酮，引起蛋白质脱去水化层，↓介电常数，↑带电质点的相互作用引起沉淀
      • 重金属盐沉淀
        • 大于等电点时，蛋白质颗粒带电荷， 易与金属离子形成不溶性的盐
        • 解救
          • 喝大量的牛乳和豆浆等蛋白质进行催吐
      • 生物碱试剂和酸类
        • 生物碱试剂
          • 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸等，与蛋白质形成盐类沉淀
        • 酸类
          • 三氯醋酸、横基水杨酸和硝酸等，与蛋白质形成盐类沉淀
      • 加热变性沉淀法
        • 加热使蛋白质的天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层； 少量盐可以加速蛋白质凝固。如豆腐的制作工艺。
  • 蛋白质分离纯化的一般程序
    • 蛋白质纯化总目标
      • ↑单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性，设法除去变性的和不要的蛋白质，目标蛋白质产量达到最高值
    • 分离纯化某一特定蛋白质的一般程序
      • 前处理
        • 选材→细胞破碎→抽提
        • 常用的破碎方法
          • ①机械破碎法；②渗透破碎法；③交替冻融；④超声波法；⑤酶消化
      • 粗分级分离
        • 目的
          • 除糖、脂、核酸及大部分杂蛋白等浓缩蛋白
        • 处理量大，既能除杂质，又能浓
        • 方法
          • 沉淀、吸附、超过滤、透析、冷冻干燥
      • 细分级分离
        • 方法
          • 层析，电泳
        • 规模较小，但分辨率高
      • 纯化分离和纯化
        • 方法
          • 离子交换层析、凝胶过滤、疏水层析、亲和层析 高效液相层析、快速蛋白质液相层析、电泳法、结晶
            • 结晶
              • 纯化方法 纯度标志 天然状态指标
              • 结晶≠均一
  • 蛋白质分离纯化的方法（页面2）
  • 蛋白质相对分子质量的测定
    • 化学组成测定最低分子量
      • 根据蛋白质中特定氨基酸含量，计算出最低分子量和分子量。
      • 测定蛋白质分子中某一微量元素的含量和每一分子中该元素的个数确定蛋白质最低分子量和分子量
        • 肌红蛋白和血红蛋白
    • 蛋白质的扩散和扩散系数
    • 渗透压法
    • 质谱法
    • 沉降速度法
    • 凝胶过滤法
    • SDS-PAGE
      • 原理
        • 阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）破坏氢键和疏水作用； 巯基乙醇可打开二硫键，使多肽处于伸展状态，改变了蛋白质单体分子构象。
      • SDS-PAGE迁移率只取决于：分子大小
    • 常用
  • 蛋白质的含量测定与纯度鉴定 （和酶活力测定结合会出计算题）
    • 测定蛋白质的总量、蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量、鉴定最后制品的纯度
    • 总蛋白质含量的测定
      • 双缩脲法
        • 快速检测，精确度稍差
      • 紫外吸收法
        • 精确度低，操作简单，样品可回收
      • 福林-酚试剂法
        • 标准方法
      • 考马氏亮蓝G-250法
        • 灵敏度高，重复性好
      • 主要
      • BCA法
        • 与福林-酚试剂法相似
      • 凯氏定氮
        • 标准方法，烦琐
      • 胶体金测定法
        • 灵敏度最高
    • 混和样品中特定蛋白质含量测定
      • （1）方法的特异性强； （2）方法的灵敏度要高； （3）方法的准确度要高； （4）方法要方便、快速，
    • 蛋白质纯度鉴定
      • 采用≥2方法检验纯度 纯度要求↑，用的方法↑
      • 电泳分析
        • 常用
        • 纯的蛋白质在它稳定的范围内不同的值下电泳时电泳图谱只有一条带
      • 超速离心沉降分析
        • 不适用于电泳法的分析
      • 层析性质的考查
        • HPLC 在证明蛋白质均一的分辨率接近电泳法
      • 免疫化学法
        • 免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳、酶标免疫分析、发光免疫分析和 Western blotting
      • 蛋白质化学结构分析法
        • N末端分析：每摩尔蛋白质应当有整数摩尔的 N-末端氨基酸。
      • 溶解度曲线法
        • 蛋白质制品是纯的，溶解度曲线呈现一个折点，在折点以前斜率为1，折点以后斜率为0 不纯的蛋白质溶解度曲线呈现≥2的折点

蛋白质分离纯化的方法

• 分离纯化的依据
  • 盐析 （最有效，最常用）
    • 加入大量中性盐，溶液中自由水→盐离子的水化水，破坏蛋白质水化层， 由于疏水作用使蛋白质聚集沉淀
  • 有机溶剂分级沉淀
    • 有机溶剂的加入使水的介电常数↓，介电常数的↓将↑两个相反电荷之间的吸引力。蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度↓，水化程度↓，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。
    • 与蛋白质分子争夺水化层，使蛋白质聚集而沉淀
  • 透析和超过滤原理
    • 透析
      • 将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋中放在蒸馏水中进行，透析外液可以更换，直到透析袋里无机盐等小分子物质降低到最小值为止。
    • 超过滤
      • 利用压力和离心力，强行使其它小分子和水通过半透膜，而目标蛋白质留在膜上或一侧。利用超过滤器可以进行分子量段截留。
      • 蛋白质分子不能透过半透膜 使蛋白质与其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开
  • 离心
    • 差速离心法
    • 密度梯度离心法
      • 速率区带离心 等密度离心
  • 凝胶过滤层析 （排阻层析/分子筛层析）
    • 原理
      • 大分子先被洗脱
    • 凝胶种类
      • 交联葡聚糖凝胶（Sephadex)
        • ①Sephadex G，G后的数字为凝胶吸水值的 10倍。反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。 ②SephadeX LH-20，是 Sephadex G-25的独丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂,用于分离不溶于水的物质。
      • 琼脂糖凝胶
      • 聚丙烯酰胺
    • 应用
      • 生物大分子物质的分离纯化; 分子量的测定； 分级分离： 溶液浓缩； 细胞及颗粒的分离 凝胶过滤法测定相对分子量
  • 电泳
    • 类型
      • 自由电泳（无支持体）
      • 区带电泳（有支持体）
        • 按支持介质种类
          • 纸电泳
          • 醋酸纤维素薄膜电泳
          • 淀粉凝胶电泳
          • （聚丙烯酰胺凝胶电泳） PAGE
            • 非变性
              • 物理效应
                • 样品浓缩效应. 电荷效应
                • 分子筛效应
                  • （大小、形状；分子大，慢，分子小，快）
            • 分类
              • 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胶凝胶等电聚焦电泳 双向电泳
          • 琼脂糖凝胶电泳
            • 普通琼脂糖凝胶分离 DNA的范围为0.2-20kb 利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段
          • 毛细管电泳
            • 有助于消除由于热引起的扩散增加而造成的对流和区带变宽
        • 按支持介质形状不同
          • 薄层电泳、板电泳、柱电泳
        • 按用途
          • 分析电泳、制备电泳、定量、免疫电泳
        • 等电聚集IEF
          • 可分离蛋白质、测定蛋白质等电点
        • 双向（二维）电泳
          • 第一向：IEF 蛋白质组 第二向：与SDS-PAGE结合
  • 离子交换层析
    • 改变盐离子浓度或pH
    • 步骤
      • （1）平衡；(2）上样和冲洗；(3）洗脱；(4）再生
    • 离子交换剂的类型
      • 支持介质的不同
        • 离子交换纤维素 离子交换琼脂糖
        • 离子交换葡聚糖
          • 既能根据净电荷数量又能根据分子大小进行分离
        • 离子交换树脂
          • 大分子的分离
      • 离子类型不同
        • 强酸性、弱酸性、强碱性、弱碱性
    • 纤维素离子交换剂
      • 阳离子交换剂
        • CM一纤维素 P一纤维素 SE一纤维素
      • 阴离子交换剂
        • AE一纤维素 DEAE一纤维素 TEAE一纤维素
    • 优点
      • ①灵敏度高、容量大、可操作性、重复性、样品集中: ②分离纯化不同阶段及不同规模均可。
    • 缺点
      • 影响因素多，缓冲液的筛选和条件困难
  • 疏水作用层析
    • 按蛋白质疏水性差别
    • 在高盐条件下上柱， 按低盐、水和有机溶剂顺序洗脱
    • 过程
      • 平衡、上样、冲洗和洗脱
    • 影响因素
      • 蛋白质的疏水性
        • 不同蛋白质的疏水位区和疏水口袋的数目、大小、形状和亲脂性不同
      • 疏水吸附剂种类
      • 蛋白质的环境
        • 在水相中↑中性盐的浓度或↓乙二醇的浓度可↑疏水作用，反之↓
    • 缺点
      • 洗脱条件可引起蛋白质变性，层析效果的无规律性，必须进行预实验
  • 亲和层析 （选择/功能/生物特异性 吸附层析）
    • 特点
      • 高度特异性和可逆性
    • 步骤
      • 配基的固相化→亲和吸附→解吸附
    • 种类
      • 凝集素亲和层析 免疫亲和层析 金属整合层析 染料配体层析 共价层析
    • 原理
      • 利用生物大分子能与特异的配基的分子非共价结合来纯化生物大分子的方法
        • 抗原和抗体、酶和底物 辅酶或抑制剂、激素和受体、 RNA和其互补的 DNA
    • 影响因素
      • 洗脱液的 pH 离子强度或降低极性等方法洗脱 加入变性剂、加入特异配体
  • 高效液相层析HPLC
    • ↑柱的理论塔板数，t恒定，↓↓支持介质的颗粒度，↑压力，以维持必要的流速的办法
  • 快速蛋白液相层析（FPLC）
    • 专门用于蛋白质分离的方法
    • 能直接分离胰蛋白酶消化液和微生物培养上清液