导图社区 真菌检验技术
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真菌检验技术
形态学检查
补充
真菌(fungus)是一类单细胞或多细胞异养真核细胞微生物。具有典型细胞核,有核膜和核仁,胞浆内有完整的细胞器,不含叶绿素,以腐生或寄生方式摄取营养,能进行有性生殖和(或)无性繁殖。 真菌细胞壁的主要成分为多糖(几丁质/甲壳质、纤维素、葡聚糖、甘露聚糖等),其次为蛋白质、类脂。在不同类群的真菌中,细胞壁多糖的类型不同。如低等真菌的细胞壁成分以纤维素为主,酵母菌以葡聚糖为主,而高等真菌则以几丁质为主。 多数腐生,少数寄生或共生。营养方式为吸收。 分布广泛、种类繁多,10万余种。 多数对人体无害甚至有益: 正常菌群(皮肤、上呼吸道、下消化道、口腔、生殖道) 食用真菌(灵芝、冬虫夏草、木耳、香菇等) 医药工业(酿酒、发酵、生产抗生素等) 少数有害:医学(病原)真菌400种,常见的有50-100种。人类及动、植物疾病(真菌病、过敏性疾病、真菌毒素中毒症、肿瘤)。 医学真菌:致病真菌、条件致病真菌、致敏真菌、产毒真菌、致癌真菌、诱癌真菌等。 目前大多数真菌的鉴定,形态学(包括真菌形态、菌落形态)检查仍有重要意义 。
检查方面 :致病性、传染性、传播途径、环境污染
1、真菌孢子可空气传播,操作应在生物安全柜进行
2、每天工作签应对工作区域进行消毒
3、不可直接闻培养基气味,以免孢子散播感染
4、不可对组织胞浆菌、球孢子菌玻片培养,因空气传播
一、标本采集注意事项
1、标本来源要适宜
2、要在用药前采集标本
3、采集标本要充足
4、采集过程中要严格无菌操作
5、采集后立即送检
二、直接镜检
1.标本制备
标本制备
常用标本处理液
(1)KOH溶液
促进角质蛋白的溶解,适于致密不透明染色标本的检查,如毛发指甲及鳞屑等
(2)生理盐水
观察真菌的出芽现象 脓汁、尿及粪便等标本可滴加少量生理盐水后直接观察
(3)水合氯醛-苯酚-乳酸封固液
消化力较强,只限于不透明标本的检查
2.显微镜检查
低倍镜——观察有无菌丝或孢子;高倍镜——检查其特征
三、染色镜检
常用染色方法
1.革兰染色
各种真菌为革兰阳性,被染成深紫色
2.乳酸酚棉蓝染色
菌体被染成蓝色
3.墨汁染色
由于检验有荚膜的菌,如新生隐球菌,背景染成黑色,菌体不着色
4.荧光染色
直接涂片染色法
阳性表明真菌存在,但不能确定菌种
培养物涂片染色法
丝状菌落:取少量标本置载玻片,滴0.1%吖啶橙溶液少许,加上盖玻片置荧光显微镜下观察
酵母型菌落,在试管内加2ml0.1%或0.01%吖啶橙溶液,与酵母菌混合2~5分钟,离心沉淀,弃去上清。加入生理盐水5ml,混匀后再离心沉淀,弃去上清液。最后用2ml生理盐水将沉淀稀释成悬液,滴加少许在玻片上,加盖玻片,置荧光显微镜下观察。
组织切片染色法
5.糖原染色(PAS)
真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成,含有多糖
过碘酸使糖氧化成醛,再与品红-亚硫酸结合,成为红色
6.六胺银染色
卡氏肺孢子菌
真菌被染成黑色或黑褐色
7.瑞氏染色
常用于组织或骨髓标本中组织胞浆菌和马尔尼菲青霉菌等
8.黏蛋白-卡红(MCS)染色法
新生隐球菌的鉴别
隐球菌细胞壁和荚膜染成红色,细胞核为黑色
四、形态学检查意义
优点
1、有诊断意义:可以判断有些真菌种致病性
2、代表组织相:镜检看到真菌的形态就是该真菌的组织形态
局限性
1、灵敏度低:直接镜检不如培养敏感,可能会使假阴性
2、假阳性:溶解的淋巴细胞在脑脊液印度墨汁复染会被误认成新生隐球菌
培养与鉴定技术
一、分离培养
工具
平皿、试管、培养箱、接种针、接种环和接种钩
培养基
营养要求不高,最适PH4~6。
常用真菌培养基及用途
沙保弱培养基——真菌的常规培养
放线菌酮-氯霉素琼脂——真菌常规培养
玉米粉聚山梨脂-80琼脂——观察白假丝酵母菌的厚膜孢子
马铃薯葡萄糖琼脂——观察真菌菌落色素,用于鉴别
尿素琼脂——用生化反应鉴别真菌(红色癣菌和石膏样癣菌)
心脑浸液葡萄糖琼脂——深部真菌培养
培养方法
试管培养法
最常用、用于菌种传代接种。
使用方便、不易污染;但展示面积不够,不能完全显示菌落形态
大培养法
用培养皿或大型培养瓶装入培养基,接种标本
菌落大,易于观察;但接种易受污染
小培养法
微量培养法,是观察真菌结构及生长发育的有效方法
包括玻片培养、小型盖片培养、琼脂方块培养法等
生长现象(菌落)
1、生长速度
与菌落培养有关
快速生长(7-10d出现菌落)、慢速生长(3周内出现少许菌落)
2、菌落大小
与菌种、生长速度、培养环节、培养时间长短有关
3、菌落性质
酵母型、类酵母型、丝状菌落
丝状菌落可呈现棉絮状、绒毛状、或粉末状等形态)
4、菌落颜色
不同菌种有不同颜色、丝状菌落的表面和底层颜色不同
5、菌落边缘
有的整齐如刀、有的呈羽毛状
6、菌落底部
有的会陷入培养基、有甚至会使培养基开裂
二、鉴定试验
1.毛发穿孔实验
某些皮肤癣菌通过特殊的菌丝附属器——穿孔器官而使毛发穿孔
石膏样小孢子菌穿孔试验阳性;红色毛癣菌穿孔试验阴性
2.明胶液化试验
某些真菌具有明胶酶,将明胶蛋白分解成小分子物质,使其低温下也不能凝固
主要用于鉴别着色真菌、链丝菌、放线菌及卡诺菌
3.芽管形成试验
白假丝酵母菌在动物血清中孢子伸长,形成芽管
鉴定酵母样真菌
4.厚膜孢子形成试验
鉴定白假丝酵母菌
5.酚氧化酶试验
新生隐球菌特有
6.脲酶试验
分解尿素产生大量氨,使PH升高从而使酚红指示剂呈红色
7.糖同化或发酵试验
某些真菌在不含碳源而仅含氮源的合成固体培养基上不生长
三、药物敏感实验
(一)临床常用抗真菌药物
按化学结构分
①多烯类抗生素,如两性霉素B、制酶菌素、曲骨霉素等
②吡咯类,酮康唑、伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑、克霉唑、益康唑
③其他类,氟胞嘧啶
按作用机制分
①作用于真菌细胞膜:两性霉素B、制霉菌素、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑及克霉唑等
②作用于真菌细胞壁:尼克霉素Z、卡泊芬净及普拉米星等
③作用于真菌核酸干扰真菌DNA的合成:如5-氟胞嘧啶
④其他:大蒜新素及冰醋酸等
(二)抗真菌药物敏感实验方法
1.稀释法(定量)
MIC(可以观察到能抑制真菌生长的最低药物浓度,即最小抑菌浓度
主要采用肉汤稀释法、包括常、微量稀释法
实验步骤
1、试验前准备
培养基制备、药物原液配制、接种菌液制备、药物稀释
2、常用方法
常量稀释法、微量稀释法
3、结果观察
观察各管(孔)生长情况
4、质量控制
采用标准菌株作为每次测定质控菌株,其MIC应落在预期值范围里
2.纸片扩散法(定性)
具体操作同“细菌药敏试验纸片扩散法”相似
其他非培养技术
一、免疫学检验
皮肤试验
提取真菌抗原、进行皮内注射或斑贴实验,观察注射或实验部位有无红肿硬结
血清学测定
用乳胶凝集、酶联免疫、补体结合、荧光抗体及放射实验测定血清该抗体水平
二、分子生物学检验
DNA 探针杂交、PCR及脉冲凝胶电泳分析(PFGE)等
常用检测片段:18SrRNA、P450、5SrRNA、gp43、26SITS
三、G试验和GM试验
G试验
检测真菌细胞壁成分(1,3)-β-D-葡聚糖
早期诊断多种常见的侵袭性真菌感染疾病(侵袭性念珠菌病、侵袭性曲霉菌病及肺孢子菌肺炎等),不能检测隐球菌和接合菌感染
GM试验
检测半乳甘露聚糖(GM)
存在于曲霉菌细胞壁的一种多糖
侵袭性曲霉菌感染的早期依据