导图社区 体内药物分析脑图
一张思维导图带你了解体内药物分析的知识，包含体内样品的种类、体内样品的采集与制备、体内样品的储存与处理、样品处理目的、常用体内样品处理方法。
以下讲述了体内样品分析方法与方法验证，包括分析方法的选择、分析方法建立的一般程序、分析方法的验证等，收藏下图学习吧！
药物分析法思维导图，知识内容有药物分析方法的验证、分析目的与样品制备、样品基质与样品制备、样品制备的常用方法。
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体内药物分析
常用体内样品的制备与储存
体内样品的种类
体内样品的采集与制备
血样
体内药物分析最常用样本，其中血浆最常用
血样的采集：一般静脉采血，每次0.2-5ml，采血量不超过该动物总血量15%-20%
血浆的制备：加入含抗凝剂管，离心，淡黄色上清液即为血浆 抗凝剂-肝素、EDTA、枸橼酸盐、氟化钠、草酸等
血清的制备：放置30min-1h,离心，淡黄色上清液即为血清
全血的制备：加入含抗凝剂管，保持匀相
尿样
主要用于药物的物质平衡、排泄途径及尿清除率研究
特点：收集量可以很大，浓度变化较大，一般以某一时间段或单位时间内尿中药物总量表示
尿样采集：包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿；应测定一段时间内排入尿中的药物总量；测完总体积后留取适量分析，其余弃去
储存：加入适当防腐剂
唾液
一些药物的唾液浓度（S）与血浆游离浓度（P）呈密切正相关，因此可能在TDM中利用测定S代替P，也可用于药物动力代谢学的研究
唾液及其组成
腮腺、舌下腺、颌下腺（静息时1,3占90%）
1200ml/day
蛋白质总量接近血浆蛋白质的1/10
pH6.2-7.4
唾液的采集：漱口后15min，刺激少，自然流出的；若需短时大量，可用物理或化学法
样品制备：立即测量除去泡沫部分的体积，放置后分泡沫、透明部分、白色沉淀三部分；分层后离心，去上清作样品
组织
药物在脏器组织中的分布情况可为药物的体内动力学过程提供重要信息
样品制备：脏器样品需制成水性基质匀浆溶液，再萃取
组织样品的处理
沉淀蛋白法：在组织匀浆液中加入蛋白沉淀剂，沉淀后取上清；操作简单，回收率低
酸水解或碱水解法：加入一定酸或碱，水浴加热，液化后过滤和离心，取上清液供萃取用；只适合在热酸或热碱条件下稳定的少量药物的测定
酶水解法：最常用蛋白水解酶中的枯草菌溶素，在pH7-11使蛋白质肽键降解，50-60℃最大活力；加入培养后，过滤或离心取澄清液或上清液供药物萃取
可避免药物在酸及高温下降解
改善与蛋白质紧密结合的药物的提取回收率
用有机溶剂直接提取酶解液无乳化现象
HPLC时不需进行过多净化操作
不适用与碱环境下易水解药物
头发
可获得长期的用药史信息，含量低，处理繁杂，干扰多
用于微量元素测定，用药史的估计，临床用药物和非法滥用药物的甄别以及毒性药物的检测
采集：枕部取样最佳
洗涤：丙酮-水-丙酮
处理
甲醇提取
酸水解（最常用）
碱水解
酶水解
体内样品的储存与处理
冷藏与冷冻（最常用）
血浆和血清
及时分离，最晚不超过2h
EP管中密塞保存
短期冰箱（4℃），长期冷冻柜（-20℃或-80℃--70℃）
加入防腐剂：甲苯、二甲苯、三氯甲烷、醋酸、盐酸等
24-36h可置于冰箱，长期应冰冻（温度同上）
4℃以下保存
冷冻保存时，解冻后应搅拌均匀，解冻样品应一次测定完毕，不反复冻融-可分小体积分装冷冻
去活性
防止含酶药物采样后进一步代谢，须终止酶活性
液氮快速冷冻
微波照射
匀浆及沉淀
加入酶活性阻断剂或抗氧剂
酯酶抑制剂
存在全血、血浆、血清
防含酯键药物降解
可多种联用
胞嘧啶脱氨基酶抑制剂
维生素C可抗药物（如利福平）自身氧化
调节pH
甲酸、醋酸、磷酸、枸橼酸或缓冲盐溶液等
样品煮沸
体内样品处理
样品处理目的
使待测药物游离
满足测定方法要求
改善分析环境
常用体内样品处理方法
蛋白沉淀法
溶剂沉淀法
加入亲水有机溶剂，溶液介电常数下降，蛋白质分子间静电引力增加而聚集；亲水性有机溶剂的水合作用使蛋白质水化膜脱水而析出沉降
乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃等
血浆（血清）：水溶性有机溶剂=1：（2-3）离心，可去除90%左右蛋白质
上清液呈碱性，pH8.5-9.5
高速离心时最好控温
中性盐析法
加入中性盐，溶液离子强度发生变化，部分蛋白质电性被中和，蛋白质因为分子间电排斥作用减弱而凝聚；中性盐的亲水性使蛋白质水化膜脱水而洗出沉降
饱和硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等
1:2混合离心可去除90%蛋白质
上清近中性，pH7-7.7
上清大量不挥发性无机盐，适用于HPLC,不适用LC-MS/MS
强酸沉淀法
溶液pH低于蛋白质等电点时，蛋白质以阳离子存在，可与酸根阴离子形成不溶性盐而沉淀
10%三氯乙酸、6%高氯酸
1:0.6离心，去除90%
上清强酸性
用于HPLC，不宜LC-MS/MS
热凝固法
加热至90℃，离心
分离与浓集
液相萃取法
溶剂选择原则
对药物分子未电离形式可溶，对电离形式不溶
沸点低，易挥发
与水不相混溶
无毒，不易燃烧
具有较高化学稳定性和惰性
不影响紫外检测
溶剂用量
水相pH
碱性：pH高于pKa1-2
酸性：pH低于pKa1-2
提取操作
选择性好，成本低廉，LS-MS中广泛运用
固相萃取法
原理：吸附、分配、离子交换（过柱子）
填料分三类
亲脂型
亲水型
离子交换型
操作步骤
甲醇润湿
水或缓冲液冲洗
加样
洗脱
注意事项
体液样品过柱速度控制为1-2ml/min
冲洗液和洗脱剂强度用量得当
萃取碱性药物时，洗脱剂中加酸、有机胺或氨水、醋酸铵或离子对试剂
特点与应用
亲脂性键合硅胶SPE方便省时，可用小体积甲醇、乙腈完全洗脱，净化并浓集产品，不需蒸干即可进样
较亲脂药物，溶剂萃取或亲脂性键合硅胶为填料的SPE处理
碱性药物，宜用大孔吸附树脂为填料的SPE
较亲水及具酸碱性、可降解的药物，离子交换型填料SPE
较亲水但不解离的药物，沉淀蛋白后直接进样
超滤法
不引入化学试剂、没有相态变化、对待测药物破坏性小
缀合物的水解
酸水解法
酶水解法
葡萄糖醛酸苷酶
硫酸酯酶
应事先除去能抑制酶活性的阳离子
溶剂解法
溶剂解：缀合物往往可通过加入的溶剂在萃取过程中被分解
化学衍生发
气相色谱中
目的
提高挥发性
增加稳定性
生成非对映异构体
硅烷化
R-OH、R-COOH、R-NH-R，使成三甲基氯硅烷化衍生物
TMCS、BSA、BSTFA、TMSI
酰化
R-OH、R-NH2、R-NH-R
TFAA、PFPA、PFBC
烷基化
R-OH、R-COOH、R-NH-R
碘庚烷、重氮甲烷、TMAH
不对称衍生化
使对映异构体生成非对应异构体衍生物，用GC法检测
高效液相色谱中
提高HPLC灵敏度
改善色谱分离结果
要求
对反应条件不苛刻，且迅速定量
对某个样品只生成一种衍生物，副产物不干扰
试剂简单易得，通用性好
衍生化分类
在线、离线
柱前衍生、柱后衍生
衍生化方法
紫外衍生化反应
荧光衍生化反应
试剂：领苯二醛、丹酰氯、莹胺
质谱衍生化反应
非对映衍生化反应
至少一个可供衍生化的官能团
手性衍生化试剂应达到对映体纯，且与之无立体选择性
条件温和、方法简便、反应完全待测物与试剂均无消旋化发生
不易裂解回原来的对映异构体
试剂结构应有利于分离
