基因工程

生物选三基因工程思维导图，包括他的概念和基础、基本工具、蛋白质工程、操作步骤等内容，本图知识梳理清楚，非常实用，值得收藏。

基因工程

• 概念和基础
  • 概念：
    • 按照人们的愿望
    • 进行严格的设计
    • 并通过体外DNA重组和转基因等技术
    • 赋予生物以新的遗传特性
    • 从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
    • 又叫DNA重组技术
  • 基础
    • 艾弗里等的肺炎双球菌转化实验
      • 生物的遗传物质是DNA
      • DNA可以从一种生物转移到另一种生物个体
      • 先导
    • DNA双螺旋结构和中心法则的确立
      • 阐明了遗传信息流动的方向
    • 遗传密码的破译：尼伦伯格和马太霍拉纳
      • 自然界中从微生物到人类共用一套遗传密码子
      • 为基因的分离和合成提供了理论依据
  • 技术发明
    • 罗思和赫林斯基：发现质粒有复制能力，可以转移
    • 阿尔伯、内斯森，史密斯：发现第一个限制酶；后发现多限制酶，连接酶，逆转录酶
      • 为DNA的切割连接以及功能基因的获取创造条件
    • 博耶科恩实验
      • 重组DNA可以进入受体细胞，外源基因可以在原核细胞中成功表达，物种间的基因交流可以借此实现
    • 穆利斯
      • PCR技术
• 基本工具
  • 限制酶
    • 主要从原核生物中分离纯化
      • 识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列
      • 并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
    • 识别序列
      • 6个
        • EcoRⅠ
          • 产生黏性末端
          • 从大肠杆菌 R型菌株中分离
        • SmaⅠ
          • 产生平末端
      • 4、5或8
  • DNA连接酶
    • 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
    • E・coli DNA连接酶
      • 从大肠杆菌分离得到
      • 只能链接黏性末端
    • T₄ DNA连接酶
      • T₄ 噬菌体中分离得到
      • 既能连接黏性末端又能连接平末端
      • 连接平末端效率比较低
  • 基因进入受体细胞的载体
    • 改造过的质粒
      • 质粒是裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外的、具有复制能力的很小的双链环状DNA
      • 有一个至多个限制酶切位点，供外源DNA片段插入
      • 进入细胞后
        • 自我复制
        • 或整合到染色体DNA上随染色体DNA同步复制
      • 有特殊的标记基因
        • 四环素抗性基因
        • 氨苄青霉素抗性基因
        • 供重组DNA的鉴定与选择
    • λ 噬菌体的衍生物
    • 动植物病毒
• 应用
  • 植物
    • 提高农作物抗逆能力（抗虫抗病抗逆）
      • 化学防治缺点
        • 造成环境污染
        • 损害人类健康
        • 增加生产成本
      • Bt毒蛋白
        • 在某些昆虫肠道的碱性环境中表现毒性
        • 与肠上皮细胞的特异性受体结合使细胞膜穿孔
      • 蛋白酶抑制剂
        • 阻断降低蛋白酶活性
        • 刺激产生过量消化酶，引起厌食反应
      • ...(懒)
    • 改良农作物的品质
    • 利用植物生产药物
  • 动物
    • 提高动物生长速度
    • 改善畜产品的品质
    • 转基因动物生产药物
    • 转基因动物作器官移植的供体
      • 将器官供体基因组导入某种调节因子抑制抗原决定基因的表达
      • 或设法除去抗原决定基因
  • 基因工程药物
    • 工程菌
      • 用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系
  • 基因治疗
    • 正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的
    • 分类
      • 体外基因治疗（可靠）
      • 体内基因治疗
    • 三种用于基因治疗的基因
      • 功能正常的基因
      • 反义基因
      • 自杀基因
• 蛋白质工程
  • 步骤
    • 从预期的蛋白质功能出发
    • 设计预期的蛋白质结构
    • 推测应有的氨基酸序列
    • 找到相对应的核糖核苷酸序列（RNA）
    • 找到相对应的脱氧核糖核苷酸序列（DNA）
  • 概念
    • 以蛋白质的分子结构规律及其与生物功能的关系作为基础
    • 通过基因修饰或基因合成
    • 对现有蛋白质进行改造，或制造出一种新的蛋白质
    • 已满足人类的生产生活的需求
  • 生产的电子元件特点
    • 体积小
    • 耗电少
    • 效率高
• 操作步骤
  • 获取目的基因
    • 可从自然界中已有的物种中分离，也可用人工方法合成
      • 基因小，核苷酸序列已知：DNA合成仪人工合成
    • 目的基因：主要指人们需要的编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子
    • 方法
      • 从基因文库中获取目的基因
        • 概念：将含有某种生物不同的基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库
        • 分类
          • 基因组文库
            • 概念
              • 将某种生物体内的DNA全部提取出来
              • 用适当的限制酶将DNA切割成一定范围大小的DNA片段
              • 将DNA片段与载体连接起来
              • 导入受体菌群体中储存
                • 每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段
              • 也就是说这个群体包含了这种生物的所有基因
            • 特点
              • 大
              • 有启动子（有启动作用的DNA片段）内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段）
              • 某种生物的全部基因
              • 部分基因能进行物种间的基因交流
          • 部分基因文库
            • 如cDNA文库
              • 概念
                • 用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录形成的cDNA片段
                • 与载体连接后储存在一个受体菌群中
              • 特点
                • 小
                • 无启动子内含子
                • 某种生物的部分基因
                • 可以进行物种间的基因交流
        • 如何获取（这还是一件比较复杂的事情/doge）
          • 基因的核苷酸序列
          • 基因的功能
          • 基因在染色体上的位置
          • 基因的转录产物mRNA
          • 基因的表达产物蛋白质
      • 用PCR技术扩增目的基因
        • PCR技术
          • 多聚酶链式反应
          • 穆里斯
          • DNA双链复制原理，短时间大量扩增目的基因
          • 前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列
            • 以设计引物
        • 过程
          • DNA变性：（90℃-96℃）
            • DNA解链
          • 退火：（60℃-65℃）
            • 引物结合到互补DNA链
          • 延伸：（70℃-75℃）
            • Taq酶从引物起始进行互补链合成
        • 材料
          • 两种引物
          • dNTP
          • Taq酶
          • 模板DNA
  • 构建基因的表达载体
    • 核心步骤
    • 目的
      • 使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代
      • 是目的基因能够表达和发挥作用
    • 组成
      • 目的基因
      • 启动子
        • 一段具有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端
        • 驱动基因转录出mRNA,最终获得所需要的蛋白质
      • 终止子
        • 位于基因的末端，一段具有特殊结构的DNA短片段
        • 使转录在需要的地方停止下来
      • 标记基因
        • 为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因从而将含目的基因的细胞筛选出来
      • 复制原点
  • 将目的基因导入受体细胞
    • 转化
      • 目的基因进入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
    • 导入植物细胞
      • 农杆菌转化法
        • 农杆菌
          • 自然条件下感染双子叶和裸子植物
          • 植物伤口处细胞分泌酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞
          • Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，整合到染色体DNA上
        • 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上
          • 目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达
      • 花粉管通道法
        • 植物受粉后，花粉管愈合前，减去柱头
        • 滴加DNA使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞
        • 简便经济
      • 基因枪法
        • 单子叶植物常用，成本高
        • 包裹在金属颗粒表面的载体DNA打入受体细胞，使目的基因与其整合并表达
    • 导入动物细胞
      • 显微注射技术
    • 导入微生物细胞
      • 原核生物优点
        • 繁殖快，多为单细胞，遗传物质较少
      • 感受态细胞法
        • Ca2+处理细胞
        • 感受态细胞：能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态
        • 重组的表达载体溶于缓冲液与感受态细胞混合，在一定温度下
  • 目的基因的检测与鉴定
    • DNA分子杂交技术
      • DNA上是否插入了目的基因
      • 探针：放射性同位素标记的目的基因的DNA片段
      • 探针与转基因生物的基因组DNA杂交
        • 有杂交带，目的基因已插入染色体DNA中
    • 分子杂交技术
      • 目的基因是否转录出来mRNA
      • 标记的目的基因做探针
        • 有杂交带，目的基因已转录出了mRNA
    • 抗原-抗体杂交
      • 转基因生物中提取蛋白质，用相应抗体进行抗原-抗体杂交
    • 个体生物学水平的鉴定
      • 抗虫或抗病接种实验
      • 与天然产品功能活性比较