PCR

多聚酶链式反应（核酸体外扩增）临床分子生物学检验技术思维导图，包括靶序列扩增、其他PCR技术、PCR产物分析三部分内容。

核酸体外扩增及定性检测技术(PCR)

• 靶序列扩增
  • PCR扩增技术
    • PCR技术原理及基本过程
      • 变性（94℃~95℃），退火（40℃~70℃），延伸（72℃）P58
    • PCR反应体系及扩增参数
      • 反应体系
        • 模板（1μl）
          • 基因组DNA，RNA，质粒DNA，线粒体DNA
        • 引物（1μl）
          • 体内的引物：RNA
          • 体外的引物：DNA
          • 位置：以RNA为模板扩增时，引物设计时两条引物要在不同的外显子序列内
          • 长度：20~30个核苷酸
          • 二级结构：避免形成二级结构或二聚体
          • Tm值：两条引物的Tm值之差应控制在2~5℃，Tm=2（A+T)+4(C+G)
          • 碱基分布：随机分布，C+G碱基含量一般为40%~50%
          • 末端修饰：3'段不能加修饰成分，尽可能选择A或T，5'段可加修饰成分
        • dNTPs（5μl）
          • 浓度过高非特异性扩增将增加
        • 缓冲液（4μl）
          • PH=8.3~8.8，这样延伸时PH变为7.2左右（Taq酶的最适PH）
        • Taq酶（0.25μl）
          • 酶量过多不仅浪费，而且会使非特异性扩增增加 P59
      • 扩增参数
        • 温度
          • 变性（94℃~95℃），退火（40℃~70℃），延伸（72℃）退火温度=引物Tm-5℃
        • 时间
          • 第一次变性（约5分钟），进入循环后变性时间一般为30s~1min；退火时间与引物长度有关，一般为30s
        • 循环次数
          • 目的片段在第三个循环才第一次出现，一般进行20~40个循环；扩增20~25个循环后，产物增加出现”停滞效应“，进入”平台期“
• 其他PCR技术
  • 多重PCR
    • 加入多对引物，同时扩增一份DNA样本
    • 用途：分型和鉴定（病原体分型，法学鉴定）
  • 逆转录PCR（RT-PCR）
    • 逆转录酶
    • 引物
      • 以合成的寡聚脱氧胸苷酸（oligo（dT））作为引物
      • 以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物
        • cDNA产量最多
      • 以PCR扩增下游产物的特异性下游引物作为引物
        • cDNA产量低，但特异性强
    • 用途：RNA病毒检测，分析RNA表达情况
  • 巢式PCR
    • 对靶DNA进行二次扩增，第二次扩增所用的模板为第一次扩增的产物
    • 第二对引物在靶序列上的位置应设计在第一对引物的内侧
    • 提高反应的灵敏度和特异性
  • 长片段PCR（LD-PCR）
    • 扩增长度
      • 5kb以上（普通PCR扩增长度为2~3kb以内）
    • 引物
      • 较长的引物和较高的Tm值
    • 聚合酶
      • 双聚合酶系统
        • 主导酶：Taq酶-延伸
        • 校对酶：Pfu酶-5'-3'外切酶活性-校对
    • 缓冲液
      • 较高缓冲能力及高PH
• PCR产物分析
  • PCR-限制性片段长度多态性P65
    • 限制性核酸内切酶 点突变