液相色谱

食品分析中液相色谱的知识点，可用于考试复习。主要包括分类、液相色谱组成、HPLC常见问题这三个部分的详细阐述。

液相色谱

• 分类
  • 按溶质在分离过程中的原理
    • 吸附色谱
    • 分配色谱
    • 离子交换色谱
    • 体积排阻色谱
    • 亲和色谱（抗原-抗体间的亲和力）
  • 按流动相与固定相之间相对极性的大小
    • 正相色谱：固定相极性＞流动相
    • 反向色谱：固定相极性＜流动相
    • 有时一根色谱柱可以做正相色谱也可以做反向色谱
    • 试剂极性排序
• 液相色谱仪组成
  • 硬件部分
    • 输液系统
      • 溶剂柜
      • 真空脱气机
        • 防止空气进入柱子，防止加压时空气形成气泡
      • 溶剂混合器
        • 等度洗脱
          • 统一分析周期内流动相组成保持恒定，适合组分数目较少，性质差别不大的样品
        • 梯度洗脱
          • 采用两种或多种极性不同的溶剂，在分离过程中按一定程序改变流动相的浓度配比和极性，适合分析数目多，性质差异较大
      • 高压泵（核心）
        • 设定流速+提供压力
    • 进样系统
      • 作用：把分析试样有效送进色谱柱进行分离
      • 要求：进样量重现性好
      • 分类
        • 自动进样器
        • 手动进样器
          • 六通阀
            • 背面有6个通路，有1个定量环，定量环有固定体积，能控制柱子的进样量
            • 进样量应不小于定量环体积的5-10倍（最少3倍）
    • 分离系统
      • 色谱柱
        • 铭牌
          • C18，填料为C18
            • 填料为氨基柱的是分析糖的，分析糖不能选C18这种极性小的，没相互作用，出峰都在一起了
          • 250×4.6mm，长度250mm，内径4.6mm
            • 柱子的内径会影响流速
            • 小内径
              • 省流动相，省样品
                • 适合液质联用中的质谱分析（不需分流）
                • 如ESI源用很少的辅助气体就能使样品电喷雾离子化
              • 流速小
                • 分离结果受死体积影响大
                • 色谱峰扩展
              • 对仪器（进样器和高压泵计量水平）要求高，称量时难度大
            • 大内径
              • 优点
                • 对进样器以及高压泵计量水平要求不高
                • 连接管路体积对分离度影响变得不明显
              • 缺点
                • 内径越大流动相流速越高
                • 进样用量与流动相用量增加
            • 内径与流速的关系
            • 长度
              • 长度↑，分离效果商，但是柱压↑，仪器可能不工作了
                • 扩散现象明显，峰宽变大
              • 长度通常有30mm,50mm,100mm,150mm,200mm,250mm
              • 方法开发初期，可以选择不同固定相的短柱（50或100mm）进行快速检测；然后要求保留时间延长，分离度提高时，选择长柱（150或250mm）进一步优化分离条件进行分析实验
              • 使用短柱可以快速分析，节约时间，减少溶剂使用量
              • 分析时间、柱效、柱压和柱长成正比
              • 分离度与柱长的平方根成正比，分离度增加2倍柱长需要增加4倍
              • 在分离度变化不明显以及对分离要求不高的实验中，一般建议使用短一些的色谱柱（常用150mm）
          • 5μm，粒径为5μm
            • 粒径↓，分离度↑（待测样品分离次数↑），但是压力↑，所以常用3μm、5μm，超高压液相色谱仪1.7μm
            • 比如C18，4.6×250mm，就没有3μm的柱子，不然压力太高
            • 常用粒径（μm）1.7，3,5,7
              • 1.7μm属于超高压色谱柱，柱长短，分离效果好，但是要特殊超高压色谱仪配套
              • 3μm，5μm色谱柱最常见（如硅胶基质填料的色谱柱）
              • 7μm常见于大孔聚合物填料的一些色谱柱（如聚合物填料的离子交换柱）
            • 填料颗粒孔径
              • 孔径大小与填料表面积成反比，同样的高密度键合浓度条件，孔径↓，填料表面积↑，对化合物保留性↑，保留时间↑
        • 流动相
          • 要求
            • 良好的化学稳定性
            • 适当的沸点和黏度
            • 对分离物有一定溶解性
            • 适合所使用的检测器、清洗方便
          • 高极性：水、甲醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃
          • 低极性：正己烷、正庚烷、二氯甲烷
        • 固定相
          • 要求
            • 有较高的机械强度，能承受高压
            • 有较高的化学稳定性，能承受较宽的pH范围
            • 有较高的孔容
            • 颗粒均匀，尺度合适（分析型颗粒直径3-10μm，制备型颗粒直径约20-40μm）
          • 材料（两部分）
            • 载体基质
            • 修饰基团
          • 常用HPLC分离填料
            • 无机基质：硅胶、氧化锆、氧化铝、二氧化钛
            • 硅胶
              • 优点：机械强度高、粒径均匀、孔径大小适当
              • 缺点：容易产生不可逆吸附，载样量相对较小，对生物大分子分离适用能力差
            • 交联聚合物：聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、多糖凝胶
            • 有机基质的特点
              • 优点
                • 高分子材料基质微球，易进行化学改性，填料具有良好色谱柱选择性
                • 对分离样品有较强的负载能力，有较高的色谱容量
                • 耐酸/碱/溶剂处理，可以在广泛的pH范围使用，较长的柱寿命和较好的柱再生能力
              • 缺点
                • 颗粒刚性不如无机基质填料好
                • 孔结构比较复杂
                • 在淋洗体系的变化过程中产生膨胀或收缩现象
            • 共聚物微球（应用最广的一类基质树脂）
              • 具有良好的颗粒刚性
              • 小而均匀的粒度
              • 适宜的孔径大小和分布
            • 复合材料：无机基体复合一层聚合物
          • 性能指标与选择方法
            • 常规
              • 含有未被修饰的-OH（羟基），酸性的
              • 对碱性物质有强的保留作用，不易洗脱（碱全反应了），实在不行可以给流动相加甲酸
              • 容易造成拖尾现象，适用于酸性、中性化合物的分离
            • 封端
              • 裸露的羟基被有机基团封闭
              • 适合碱性物质（如生物碱）的分离，适用于碱性、中性化合物的分离
              • 酸性也能分离
            • 键合相类型
              • 烷基：C1、C2、C3、C4、C6、C8、C12、C16、C18、C22等反相柱
              • 苯基
                • C6H5-,C6F5-，含有π-π相互作用
              • 氰基
                • 带有给电子作用、羟基的氢键作用；正相反相均可
              • 氨基
                • 弱阴离子型键合相，可用于糖分析
              • 其他极性
                • 二醇基；硝基；二甲胺基等
            • 不同分离模式
              • 正相色谱填料
                • 表面有羟基、氨基、氰基、羧基醚链等极性基团或链段，包括硅胶填料（吸附）色谱柱
              • 反相色谱填料（使用最为广泛）
                • 颗粒表面主要含C18/C8烷基及苯基等强疏水性基团或链段
              • 离子交换色谱填料
                • 季氨基、磺酸基、羧基阴阳离子交换基团
                • 主要用于离子化合物，或在酸碱条件下易形成带电离子的化合物分离
              • 空间排阻色谱填料
                • 颗粒表面结构
                  • 亲水性（主要含羟基）
                  • 亲油性
                • 如凝胶色谱，葡聚糖色谱，主要用于抗原蛋白，生物激素等大分子化合物的分离
              • 亲和色谱填料
                • 颗粒表面携带有蛋白质、抗体、激素、抗菌素、酶等极性基团或链段
                • 主要用于抗原蛋白，生物激素等大分子化合物的分离
            • 常用的几种色谱柱适用的分离化合物的范围
              • 氨基柱
                • 常用于分离分析糖类化合物
              • 氰基柱
                • 常用于碱性药物，生物碱，类固醇化合物的分离
              • 苯基柱
                • 常用于芳香以及杂环芳香化合物的分离，比如嘌呤、嘧啶、咖啡碱等
              • 硅胶柱（正相柱）
                • 低极性和中等极性化合物的分离，对高极性化合物的保留性很强
              • C8和C18（反相柱）
                • 范围广泛，用于中等极性和高极性化合物的分离（注意硅羟基是否封闭）
              • 有机酸柱
                • 对极性强的有机酸有良好的分离和保留作用，适用于有机酸和水溶性维生素的分离
        • 如何选择色谱柱
          • 判断需要进行分离的化合物的结构性质（极性以及分子大小）
          • 选具有合适固定相的色谱柱
          • 恰当的孔径（根据样品量、流速、检测器要求）
          • 合适的柱长（分离效果和柱压综合考虑）
          • 经过优化后，进行最终的分离分析实验
      • 柱温箱
        • 在分析VA和VD的时候，如果时间太长不设柱温，两个峰就分不开
    • 检测器
      • 紫外检测器
        • 液相色谱最常用的检测器，HPLC中，约有80%的物质可以用紫外吸收检测器检测
        • 特点：灵敏度高，线性范围宽，对流速和温度不敏感
        • 主要参数是选择检测波长，考虑溶质和流动相的吸收特性，溶剂必须能让所选择的光透过，所选波长不能低于溶剂的最低使用波长
        • 分类
          • 固定波长型
            • 结构紧凑
            • 造价低
            • 操作维修方便
            • 灵敏度高
            • 适用于梯度洗脱
          • 可变波长型
            • 先进行分光，然后检测
            • 紫外可见分光
            • 选择性大
          • 二极管阵列
            • 光先经过样品，然后再分光，可以在得到色谱图的同时得到光谱图
            • 检测全波长的信号定量的同时也可光谱定性，能看到每1秒的全测量光谱（相当于是3维的图）
            • 但是保留时间一样的不一定是同一种物质
      • 示差折射检测器（RID）
        • 通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定溶质浓度
        • 由于折射率是物质的通用性质，示差折射检测器是一种通用型的整体性质检测器
        • 原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光折射率不同，其中一束光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录
        • 特点
          • 通用型检测器，灵敏度低，需要浓度足够高时才能检测
          • 对温度变化敏感
          • 不能梯度淋洗
      • 荧光检测器（FLD）
        • 特点
          • 特别灵敏，适合低含量物质的测定，适合痕量分析，一般可测ppb级的化合物
          • 有选择性
        • 用于检测物质本身具有荧光或为了提高灵敏度将无荧光的物质衍生成荧光体
        • 可用荧光检测的物质：某些代谢物、食品、药物、氨基酸、多肽、胺类、维生素、石油高沸点馏分、生物碱、甾族化合物
        • 比色皿四面透光，平行方向是吸收光谱，垂直方向是发射光谱，荧光测垂直方向，背景低干扰少，光都是物质发出的光
      • 电化学检测器
        • 对于有电活性的物质，在液相色谱中可采用电化学检测器，用的最多的是安培检测器
        • 检测限在四种里面最低，10^(-12)g/mL；其次是荧光，10^(-11)
        • 安培检测器——化合物有氧化还原性
          • 利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间有电流通过，电流大小和待测物浓度成正比
          • 葡萄糖含量高的时候用示差折射，低的时候用安培
          • 流动相必须含有电解质，且呈化学惰性
          • 适合与反相色谱柱匹配，只能检测具有电活性的物质
        • 电导检测器——离子电导性（常用来测离子），用缓冲液做流动相时，检测灵敏度下降
        • 注意：做实验的时候pH不能动，不然影响氧化还原电位值
        • 注意：流动相要稳定，不能用梯度的
          • 如果测到一半没信号，可能是流动相用了梯度
        • 注意：对流速敏感
  • 软件部分
    • 色谱数据处理系统
• HPLC常见问题
  • 柱压过高
    • 可能是温度太低，流速太高，流动相黏度大，管路堵塞
    • 新柱子接到仪器后柱压过高：入口滤片被固体颗粒堵塞
    • 进样次数↑柱压↑：样品中含有微小颗粒物or样品在流动相中析出微小结晶
    • 缓冲液做流动相时，柱压升高快：柱子里面有霉菌
    • 用5μm颗粒填柱时，以MeOH/H2O作流动相时柱压较高：MeOH与水之间有氢键作用黏度大
  • 柱压过低or没压力
    • 温度太高；流速太低；泵关闭或保险丝断了
  • 压力不稳
    • 压力传感器有问题
    • 泵排气不稳or泵失效
    • 流动相未脱气
    • 所用溶液不混溶或易挥发
  • 基线噪声
    • 基线不稳定（不重复）
      • 检测池有大气泡；流路中有小气泡
      • 系统未稳定或未达化学平衡
      • 流动相被污染
      • 检测器流动池泄露
      • 色谱柱污染
    • 短程振荡
      • 泵压不稳，泵堵塞
      • 溶剂混合不充分
      • 检测池有大气泡
    • 长程振荡
      • 温度波动
      • 溶剂被循环通过系统
    • 噪声脉冲尖刺
      • 流路中有小气泡
    • 基线漂移
      • 柱子没有平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡
      • 柱温不恒定
      • 流动相没脱气
      • 流动相发生变化，比如蒸发
      • 流速发生变化，没有恒定
  • 柱效低
    • 样品在流动相中溶解性不好，影响传质
      • 可以更换连接管，重新连接色谱柱，降低死体积
    • 色谱柱柱效低，分离不好
      • 填料被流动相溶蚀而流失
      • 流动相pH值及组成不合适造成固定相流失
      • 流速急剧变化造成固定相损坏
      • 机械振动造成柱床产生裂缝，柱床收缩或干涸
      • 出现双峰：入口填料被污染变质or长时间放置柱床层干裂，放的时候没用溶剂填充好
      • 使用一段时间后柱效下降：柱填料被流动相溶解而流失
  • 柱使用一段时间后保留值逐渐缩短：柱中固定相流失