基因工程的酶学基础

基因工程的酶学基础脑图，讲述了分类、限制性切酶、其他水解核酸的酶、修饰酶、DNA链接酶、DNA合成酶类。

4 基因工程的酶学基础

• 分类
  • 水解酶类
    • 限制性内切酶
    • 其他水解酶类
  • 合成酶类
    • DNA聚合酶
    • 反转录酶
    • RNA聚合酶类
  • 链接酶
  • DNA修饰酶
• 限制性内切酶
  • 概念与发现
    • 限制性内切酶是细菌中发现的特异性水解外源DNA的内切核酸酶，是防御外源DNA入侵的机制。
  • 命名
  • 特性
    • 能识别外源DNA并将其水解的内切核酸酶，其水解机制与修饰系统有关，是细菌对外源DNA的防御机制
    • 同裂酶与同尾酶
      • 同裂酶
        • 是指来源不同，但具有相同的识别序列的一类限制酶（原酶的识别序列发生甲基化，不能识别时选用其同裂酶）
          • 完全同裂酶
            • 具有相同的切割位点
          • 不完全同裂酶
            • 切割位点不同
      • 同尾酶
        • 是指来源和识别序列都不同，但能够产生相同粘性末端的一组限制性核酸内切酶（帮助DNA重组，目的基因和载体无相同序列时考虑使用同尾酶）
    • 第二活力/星号活力
      • 是指在“非最适”的反应条件下，酶原有的识别特异性的降低。这种识别活力一般用*表示，也称星号活力。
  • 影响限制酶活性的因素
    • 限制酶消化反应缓冲液
    • 反应温度
    • DNA的纯度
    • DNA甲基化程度
    • DNA的分子构型
  • 分类
  • 应用
    • 用于DNA重组。
    • 绘制限制性内切酶图谱。
    • 用于限制性片段长度多态性分析。
• 其他水解核酸的酶
  • 水解RNA的核糖核酸酶（RNase）
    • • RNaseA——RNA测序；去除DNA样品中的RNA杂质
      • RNase H——水解DNA-RNA杂交分子中的RNA；合成c DNA第二条链.(可用NaOH水解全部的RNA)
  • 核酸酶S1（稻谷曲霉）
    • 活性
    • 应用
      • 去除DNA片段中突出的单链末端
      • cDNA合成时去掉第一链与第二链的发夹结构
      • 测定DNA上内含子的位置
      • 测定杂交分子（DNA-DNA或RNA-DNA）的杂交程度
  • DNase I（牛胰）
    • 活性
    • 应用
      • 切口平移法标记探针时在双链DNA上产生随机切口
      • 去除DNA
• 修饰酶
  • 碱性磷酸（脂）酶
    • 活性
      • 可水解DNA或RNA的5’磷酸，底物是
    • 应用
      • DNA重组中除去DNA片段5’-磷酸
        • 阻止自身环化/防止粘性末端自连
      • 用32P标记5’末端之前除去磷酸
        • 为多核苷酸激酶标记5’端准备5’-OH
    • 常用的碱性磷酸酶
      • 子主题
      • 子主题
  • T4多核苷酸激酶
    • 活性
    • 应用
      • DNA重组中对5’-OH末端加P基团
        • 一般是往目的基因中加P基团，相反，对载体则应该去P基团。
      • 标记DNA或RNA的5’-P基团
  • 末端转移酶
    • 活性
• DNA链接酶
  • 常用的连接酶
    • 大肠杆菌（E.Coli）DNA连接酶
      • 可催化粘末端连接，但不能连接平末端
    • T4DNA连接酶
      • 即可连接平末端又可连接粘末端
    • T4RNA连接酶
      • 连接单链DNA或RNA
  • DNA连接酶活性及应用
    • 活性
      • 催化双链DNA切口处的3-OH与5磷酸基团生成磷酸二酯键。用于连接带匹配粘末端的DNA分子。
        • 反应步骤
          • NAD+或ATP与酶反应生成酶-AMP复合物➡️酶将AMP转到DNA的5’磷酸上以焦磷酸的形式活化➡️3’ 羟基对α-磷酸进行亲核攻击生成磷酸二酯键
        • 连接反应需能量
          • E.Coli与其它细菌用NAD+供能
          • 人体、动物与噬菌体用ATP供能
        • T4DNA连接酶与大肠杆菌DNA连接酶均有该活性和应用
      • 连接双链平末端DNA
        • T4DNA链接酶有此活性和应用，大肠杆菌DNA链接酶没有此活性和应用
    • 应用
      • 连接带匹配粘末端的DNA分子
      • 连接双链平末端DNA
  • RNA链接酶活性及应用
    • 连接5’磷酸和sDNA或RNA3’-OH
    • 连接单链DNA或RNA
• DNA合成酶类
  • DNA聚合酶
    • E.coli DNA聚合酶I（DNA Pol I）
      • 活性
      • 应用
        • 切口平移法标记DNA探针
          • 探针：带有可检测标记的，能够与待测核酸互补的单链核酸
          • 5’➡️3’聚合酶活性
          • 5’➡️3’外切核酸酶活性
        • 通过取代反应标记DNA的3’凸出末端或平末端
          • 3’➡️5’外切核酸酶活性
        • 用于置换法合成cDNA的第二条链
          • 5’➡️3’聚合酶活性
          • 5’➡️3’外切核酸酶活性
        • 用于DNA序列测定
          • 5’➡️3’聚合酶活性
        • 填补dsDNA的小缺口区
    • Klenow酶/片段
      • 活性
        • 用枯草杆菌蛋白酶处理Pol I得到的大片段，具有5’➡️3’聚合酶活性& 3’➡️5’外切核酸酶活性
      • 应用
        • 随机引物法标记DNA探针
        • 通过取代反应标记DNA的3’凸出末端或平末端
          • 3’➡️5’外切核酸酶活性
        • 用于自身引导合成法合成cDNA的第二链
        • DNA序列测定
        • 通过填充反应补平或标记限制酶消化产生的3’凹陷粘末端
    • T4DNA聚合酶
      • 活性
      • 应用
        • 补平3’凹陷末端
        • 切平3’凸出末端
        • DNA序列测定（常用）
        • 通过取代反应标记DNA的3’凸出末端或平末端
    • T7DNA聚合酶
      • 活性
      • 应用
        • 补平3’凹陷末端
        • 切平3’凸出末端
        • DNA序列测定（常用）
        • 通过取代反应标记DNA的3’凸出末端或平末端
    • 修饰后的T7DNA聚合酶
      • 分类及活性
        • 化学修饰后的T7DNA聚合酶（测序酶1.0版）
          • 3’➡️5’外切核酸酶活性大部分被消除
        • 遗传修饰后的T7DNA聚合酶（测序酶2.0版）
          • 3’➡️5’外切核酸酶活性彻底被消除
      • 应用
        • DNA序列测定
    • Taq酶
  • 反转录酶
    • 发现
    • 活性
      • 多功能酶
        • 依赖于RNA的DNA聚合酶功能
        • RNase H功能即水解DNA- RNA杂交分子RNA链
        • 依赖于DNA的DNA聚合酶功能
    • 应用
      • 合成cDNA第一条链
• 只有3’凹陷/5’凸出的粘末端才能从3’端开始合成DNA。平末端和3’凸出/5’凹陷的粘末端均无模版，因此也就无法从3’端开始合成DNA，需要相应的酶水解部分核酸后才能开始合成。