临床标本

下图讲述了临床标本处理与分离纯化技术，包括临床标本的处理、生物样本分离纯化、生物样本质量鉴定等，收藏下图了解吧！

临床标本处理与分离纯化技术

• 临床标本的处理
  • 一般原则：安全、适时、足量、采集部位合理、低温及时送检
    • 标本的保存
      • DNA：短期4℃，长期-20℃及以下
      • RNA：短期-20℃，长期-70℃以下或液氮中
  • 处理方法
    • 血液标本：避免使用肝素抗凝
      • 全血标本：最常使用
      • 血清（浆）标本：外源性基因检测
      • 外周血单个核细胞
    • 棉拭子
    • 体液标本
    • 痰液标本：NaOH液化预处理
    • 组织标本
    • 细胞标本
• 生物样本分离纯化
  • DNA的分离纯化
    • 酚-氯仿抽提法
      • 原理
      • 氯仿：增大酚的极性
      • TE溶液：保证DNA稳定性，悬浮细胞，熔解DNA（最后一步）
      • EDTA：金属离子螯合酶，抑制DNA酶活性，防止DNA被降解
      • SDS：弱碱，裂解细胞
      • 蛋白酶K：降解蛋白
      • RNA酶：降解RNA
      • 饱和酚：使蛋白质变性，不溶于水
      • 再次纯化
        • NaAc：Na+中和DNA分子上的负电荷
        • 无水乙醇：使DNA中的水溶于乙醇
        • 二者作用：沉淀DNA
    • 吸附柱法
      • 原理
      • 步骤
        • 1.细胞破碎
        • 2.核酸特异性吸附在硅载体上
        • 3.洗脱核酸
        • 4.熔解吸收DNA
  • RNA的分离纯化
    • 原则：防止RNase对RNA的降解
      • 制备前用DEPC:去除RNA酶（外源性）
    • 总RNA的制备：Trizol试剂提取
      • 原理
      • Trizol作用
        • 1.变性蛋白
        • 2.抑制RNA酶；裂解细胞
        • 3.含Na离子：使DNA不溶于水
    • mRNA制备：亲和层析
      • 原理
      • n：亲和层析
    • 循环miRNA的制备
    • 长链非编码RNA的制备
  • 蛋白质的分离纯化
    • 原则：尽可能保持其生物学活性
    • 原理：利用蛋白质的性质异同
• 生物样本质量鉴定
  • 核酸
    • 含量
      • 紫外分光光度法：在1cm光程下，A260=1,双链DNA含量为50ug/ml,单链RNA的含量为40ug/ml
    • 纯度
      • A260/A280:DNA=1.8,RNA=1.8~2.0
      • A260/A230=2.0~2.5
    • 完整性
      • 凝胶电泳+荧光染色+紫外观察
  • 蛋白质
    • 浓度
    • 纯度
• 鉴定核酸最常用方法：琼脂糖凝胶电泳法
  • 原理
  • 荧光染料：EB、SyberGreen
• 指标
  • A260nm:核酸（0.1~1.0）
  • A280nm:蛋白质和酚类（纯DNA的A260/280为1.8，纯RNA为2.0）
  • A230nm:碳水化合物（纯DNA和RNA的A260/A230为2.5，比值小于2.0被污染
• 沉淀洗涤
  • 酚
    • 无水乙醇
    • 高盐溶液
    • 洗涤：70%无水乙醇
  • 柱
    • 无需沉淀
    • 加TE溶液
    • 洗涤：79%无水乙醇
• 去除杂质
  • 酚：RNA酶、酚
  • 柱：硅制剂吸附DNA去除其它杂质
• 破细胞
• DNA分离纯化基本步骤