导图社区 核酸体外扩增及定性检测技术PCR
核酸体外扩增及定性检测技术PCR,内容有PCR常见问题分析、靶序列扩增、PCR扩增技术、其他PCR技术、PCR产物分析。
这是一篇关于真菌的基本性状的思维导图,讲述了真菌的概述、真菌的形态与结构、真菌基因组特点、真菌的繁殖与培养。
糖代谢的临床生化检验知识框架:糖代谢紊乱、糖代谢紊乱的临床生化检验指标的检测与评价、临床生化检测指标在高血糖、低血糖诊治中的应用等等
这是一篇关于细菌的遗传与变异的思维导图,包含遗传与变异的物质基础:染色体DNA或核质DNA、直接插入一端新序列,造成基因的转移和重组等。
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核酸体外扩增及定性检测技术
PCR常见问题分析
1.假阳性:PCR产物、质粒、阳性对照、交叉感染
2.假阴性:PCR条件、试剂、电泳、标本处理
3.引物二聚体
4.非特异性PCR产物
如何解决
以水作为模板进行阴性对照,阴性对照目的:排除污染
采用阳性对照,看反应条件是否符合要求(用阳性标本做模板)无条带:反应条件有问题
靶序列扩增
PCR扩增技术
其他PCR技术
PCR产物分析
PCR原理的表述(定义)
PCR的特点
灵敏度高
特异性好
对模板要求低
成本低,易于推广
基本过程
变性:高温,替代体内解旋酶(又称拓补异构酶)、解链酶
退火:低温(类似复性),引物与互补的DNA模板互补结合
延伸:子链与延伸DNA加倍
扩增公式:扩增效率100%:y=x*2n次方;y=x*(1+e)n次方
反应体系
模板,作用:提供DNA合成需要 的模板
引物:决定PCR扩增的特异性,决定PCR扩增的位置(产物)、分子量
引物功能:降低非特异性,与模板链进行结合,提供一个3‘-OH末端
n
位置:上游引物与5‘端相同,下游引物与3’互补
引物有两个:上游引物-正义链;下游引物-反义链
长度:15~30bp(过长:发夹结构,过短:降低扩增的特异性)
二级结构
碱基分布:同一碱基不能连续出现5个,G+C含量40%~60%,尤其是引物的3’端避免重复的GC碱基序列(GC含量太高:非特异性结合的稳定性增加)
Tm值:决定退火温度,T=Tm-5,Tm=2(A+T)+4(C+G)
长度和碱基分布决定Tm值(所以:GC含量,碱基长度不能过低)
末端修饰:3'端要严格配对,不能进行化学修饰,5‘端可以
dNTP,作用:模板链,c链合成的原材料
TaqDNA聚合酶
作用
根据模板上的碱基选择核苷酸
能在引物的3’端催化,形成3‘-5’磷酸二酯键,使c链得以延伸,合成模板链的互补链
T<Tm,才能保证目的片段与模板链结合。对于特异性扩增,退火温度越高越好,抑制非特异性。退火温度越高,特异性越高
酶量过多不仅浪费,而且会使非特异性扩增增加
缓冲液:Mg离子,作用:是DNA聚合酶的激活剂
扩增参数
温度(降低非特异性扩增,温度很重要)
n:溶解温度
时间
循环次数:一般20~40个循环,目的片段在第三个循环才第一次出现。“指数期、线性期、平台期”PCR扩增效率称S型曲线状
多重PCR
特性:检测特定基因序列的存在或缺失时,可同时进行扩增,提高PCR检测的准确性、效率
逆转录PCR(RT-PCR)
特性:能对mRNA转录而来的DNA进行扩增(cDNA含有mRNA信息,无内含子)
巢式PCR
优点:巢式PCR可提高反应的灵敏度和特异性(采用两对引物,两对原因:模板量较低),适用于靶基因的质/量较低或其他原因导致常规PCR无法获得理想的扩增产物
PCR产物分析(点突变)
PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP):判断酶切位点是否存在点突变,一般用于突变恰好位于某一限制性内切酶的识别序列中
PCR-等位基因特异性寡核苷酸(PCR-ASO)斑点杂交
优点
分型技术简单,结果判断容易
特异性好,灵敏度高
对检材质量要求低
操作简单,省时
局限性
适于已知突变
效率低,智能检测探针对应的特定突变
对新的突变,需要重新设计探针
有时会面临结果解释困难
PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)
熔点曲线分析
优点:快捷、廉价、重复性高、可同时进行大批量样本分析等
用于遗传性疾病中致病基因点突变的检测、基因多态性分析、病原微生物基因型分析等
聚合有方向性
DNA聚合酶不能从头进行聚合
聚合从3’端开始
TaqDNA聚合酶和在人体内DNA复制所需的DNA聚合酶活性对比
同:都是5‘→3’的聚合活性
异:TaqDNA聚合酶耐高热
细胞的有
1.3’→5‘端外切酶活性(错配时切除),起校正功能
2.5’→3‘聚合活性
3.5’→3‘外切酶活性
Taq无1.活性