核酸实时荧光定量PCR

核酸实时荧光定量PCR思维导图，包括他与与常规PCR区别、Q-PCR其他要点、Q-PCR与PCR比较的优势、实时荧光定量PCR的基本原理等。

核酸实时荧光定量PCR

• 与常规PCR区别
  • 1.反应体系 常规：五要素；Q-PCR：六要素（荧光基团：实时检测产物的生成）
  • 2.反应条件 Q-PCR，每一循环结束多一步收集荧光（荧光曲线的来源）
• Q-PCR其他要点
  • 定量根据ct值和模板关系进行定量，所以要做标准曲线
  • 标准曲线、荧光曲线、ct值
    • 浓度
• Q-PCR与PCR比较的优势
  • 实时在线监控
  • 降低反应的非特异性
  • 增加定量的准确性
  • 结果分析更加快捷方便，无需电泳
• 实时荧光定量PCR的基本原理
  • n
  • 实时荧光定量PCR中常用的概念
    • 扩增曲线
    • 荧光阈值
    • 循环数（循环阈值）ct值
      • ct值与模板量有关
    • 扩增效率
  • PCR扩增的理论模式
    • 每个模板的ct值与该模板的初始拷贝数的对数存在线性关系（此曲线为标准曲线）。初始模板量越多，扩增产物达到阈值所需的ct值就越少
    • 定量原理3‘
  • 实时荧光定量PCR中的荧光化学物质
    • 前言
      • 荧光染料技术是一种非特异性的检测方法
      • 荧光探针技术是基于荧光共振能量转移（FRET）原理所建立的实时荧光定量PCR技术，特异性荧光标记：Taqman探针
    • 荧光染料技术
      • 荧光原理
      • 优点
        • 对DNA模板没有选择性-适用于任何DNA
        • 使用方便——不必设计复杂探针
        • 非常灵敏
        • 便宜
      • 缺点
        • 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性
        • 对引物特异性要求较高
          • 证明荧光染料产物特异性：做溶解曲线分析
    • 荧光探针技术
      • 荧光原理
      • 优点
        • 对目标序列的高特异性-阴性结果确定
        • 设计相对简单-与目标序列某一区域互补
        • 重复性比较好
      • 缺点
        • 只适合一个特定的目标
        • 公司标记价格较高
        • 不以找到本底低的探针
• 实时荧光定量PCR测定的数据分析
  • 绝对定量
    • 绝对定量标准曲线如何做
      • 1.取5个标准品进行不同程度的稀释，获得至少5个标准模板
      • 2.分别进行PCR扩增获得5条荧光曲线，获得5个Ct值
      • 3.根据Ct值和已知浓度模板的对数画得标准曲线
  • 相对定量
    • 内参法
      • 通常选用管家基因作为内参基因
      • 在待测的样本中的表达是稳定的
      • 实验中的干预因素对内参没有影响
      • 能与待测靶基因同时进行相同的PCR扩增
• 定模板的量
• 荧光曲线→ct→标准曲线→浓度