蛋白质的共价结构

生化第四章蛋白质的共价结构，知识点有蛋白质通论、肽、蛋白质一级结构的测定、氨基酸序列与生物进化、肽和蛋白质的化学合成。

第4章 蛋白质的共价结构

• 蛋白质通论
  • 蛋白质的化学组成和分类
    • 凯氏定氮法测定蛋白质含量
      • 牛奶事件
    • 分类
      • 蛋白质按生物学功能分
        • 支架蛋白（接头蛋白），异常蛋白
      • 按组成分
        • 单纯蛋白质
          • 单纯蛋白质的分类
        • 缀合蛋白质
          • 辅基或配体
          • 缀合蛋白质的分类
            • 糖蛋白
            • 核蛋白
            • 磷蛋白
            • 脂蛋白
            • 黄素蛋白
              • 结合的辅基可以是FAD或FMN,它们是维生素B2的衍生物，每个辅基能够接受和提供两个质子和电子。线粒体中的黄素蛋白主要是电子传递链中NADH脱氢酶和TCA循环中的琥珀酸脱氢酶。
            • 色蛋白
              • 其中以含有卟啉类的色蛋白最为重要
            • 金属蛋白
      • 按功能分
        • 有活性的蛋白质
        • 无活性的蛋白质
          • 角蛋白
      • 分子外形对称程度
        • 球状蛋白质
          • 水溶解性好
            • 疏水氨基酸侧键位于分子内部
        • 纤维状蛋白质
          • 结构作用
        • 膜蛋白质
          • 所含亲水氨基酸残基比胞质蛋白少
            • 疏水氨基酸侧链伸向外部
      • 分类
        • 单体蛋白质
        • 寡聚蛋白质
  • 蛋白质分子的形状和大小
    • 估计简单蛋白质氨基酸残基数目
      • 110除相对分子质量
    • 大小
      • 6000-10^6Da之间
        • 胰岛素
  • 蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次
    • 构型和构象
      • 构型
      • 构象
    • 蛋白质结构的不同组织层次
      • 一级结构
        • 多肽链的氨基酸序列
          • 全部信息
      • 二级结构
        • 多肽链借助氢键排列成特有的a螺旋和贝塔折叠片段
      • 三级结构
        • 多肽链借助非共价键弯曲折叠成具有特定走向的紧密球状构象
      • 四级结构
        • 寡聚蛋白质各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式
  • 蛋白质功能的多样性
    • 蛋白质序列的多样性决定了功能的多样性
    • 9种
      • 催化
      • 调节
        • 激素，反式作用因子
      • 转运
        • 子主题
      • 贮藏
      • 运动
      • 支架
      • 防御和进攻
      • 特殊功能
        • 胶质蛋白，甜蛋白
• 肽
  • 肽和肽键的结构
    • 肽链
      • 蛋白质的部分水解产物
      • 游离的激素和抗生素
      • 蛋白质
    • 肽链
      • 氨基酸连接基本方式是肽键，5条实验依据
      • 共价键除了肽键，常见还有二硫键
        • 链间二硫键
        • 链内二硫键
      • 有环状肽
      • 肽链具有极性，书写
    • 肽键
      • 部分双键的性质
      • 肽键CNO共振结果
        • 产生键的平均化，键长1.33纳米，介于1.25纳米刀，1.45纳米之间
        • 形成酰胺平面或肽平面
          • 六个原子形成一个平面
        • 限制绕肽键的自由旋转
        • 肽键成反式构型
      • 反式构型比顺式构型稳定
        • 例外x-pro中的肽键
      • 肽键亚氨基在ph 0到14内不解离
  • 肽的物理和化学性质
    • 熔点高
    • 酸碱性质
      • 游离末端a氨基
        • pka略小
      • 游离末端a羧基
        • pka略大
      • R基
    • 小肽滴定曲线
      • 溶液ph大于解离侧链pka，占优势的离子形式是该侧链的共轭碱，反之，同理
    • 肽的化学反应
      • 肽的定性和定量测定
        • 氨基末端的氨基酸残基也能与茚三酮发生定量反应
      • 借助分光光度计测定蛋白质含量
        • 双缩脲反应
          • 双缩脲相似于三肽，是由两个尿素缩合形成，有两个肽键。与碱性硫酸铜溶液反应生成紫红色化合物
          • 大于等于3肽的才能发生
    • 短肽旋光度为各氨基酸旋光度总和
  • 天然存在的活性肽
    • 激素，抗生素，毒素等等
    • （脑啡肽：镇痛），a鹅膏蕈碱—真核生物RNA聚合酶二结合，（还原性谷胱甘肽：GSH，氧化型成二硫键，无基因编码，连接方式不一样：谷氨酸的r羧基）。鹅肌肽和肌肽
    • 天然肽的一些结构在蛋白质中不存在（r肽键，贝塔氨基酸，D氨基酸），免蛋白水解酶作用，蛋白水解酶只水解L氨基酸形成的a肽键
• 蛋白质一级结构的测定
  • 蛋白质测序的策略
    • singer实验室发展起来
    • 要求
      • 纯度高，样品必须均一，知道相对分子质量
    • 基本策略
      • 片段重叠法和氨基酸顺序直测法
    • 一般策略
      • 9步
    • 拆分蛋白质分子的多肽链
      • 变性剂（盐酸胍、尿素）分开蛋白质亚基
      • 氧化剂或者还原剂断开二硫键
    • 二硫键的断裂
      • 断二硫键
        • 二硫苏糖醇（DTT）还原法
        • 巯基乙醇
          • 为了使还原反应能顺利进行，通常加入一些变性剂，如高浓度的尿素等，还可以防止氧化
        • 还原法
        • 过甲酸氧化法
          • 将二硫键氧化成磺酸基而断开
            • 氧化法
        • 利用巯基化合物打开二硫键时，用卤化烷（碘乙酸）保护巯基，以防重新氧化
        • 如果不准备使肽链重新氧化，而是进一步进行化学结构的研究，可以将巯基转化成其他的修饰形式，例如羧甲基化，烷基化等
    • 氨基酸组成分析
      • 彻底酸水解
        • 氨基酸混合物用氨基酸分析仪分析
        • 氨基酸的薄层层析
    • N端氨基酸测定法
      • sanger法
        • 二硝基氟苯反应
          • DNP一x
            • 用有机酸抽提
              • 层析法
                • 色谱仪分析鉴定
      • DNS法
        • 丹磺酰氯反应
          • 有有荧光基团，灵敏度高，微量的
      • Edman法
        • 苯异硫氰酸酯反应
          • PITC
            • 弱碱微热
              • 自动序列分析仪—edman法
                • 酶解法
                  • 质谱法等
      • 氨肽酶法
        • 常用亮氨酸氨肽酶
      • N端被封闭
        • 焦谷氨酰环化，乙酰化等。焦谷氨酸氨肽酶处理
    • C端氨基酸测定法
      • 肼解法
        • 剩下很多氨基酸肼，和一个c端氨基酸
      • 还原法
      • 羧肽酶法
        • 一类肽链外切酶，专一地从肽链的C端逐个降解，测定逐个释放的氨基酸
        • 羧肽酶A：Arg lys pro外
        • 羧肽酶B:仅末端是Arg Lys
        • 羧肽酶C：除羟脯氨酸外
        • 羧肽酶Y：所有
    • 多肽链切成小片段
      • 断裂后，肽段混合物用凝胶过滤，凝胶电泳，HPLC方法分离纯化
      • 酶解法
        • 最常用胰蛋白酶，较专一的切两种碱性氨基酸，由它提供羧基的肽键
        • 胰凝乳蛋白酶，专一性较差，切疏水氨基酸
          • ph 8_9
        • 胃蛋白酶，疏水氨基酸残基的氨基侧肽键
          • ph2
        • 糜蛋白酶
          • 切芳香族氨基酸Trp，Tyr，Phe
      • 化学裂解
        • 溴化氰化合物
          • 只切割甲硫氨酸羧基提供的肽键，含量少，片段大
    • 肽段氨基酸序列的测定
      • Edman化学降解法
        • 50-60AA
          • 蛋白质序列仪
            • 最低蛋白质量5pmol
      • 串联质谱技术
        • 15AA
          • 蛋白质量低于pmol
            • 准确度高，测速快
        • 通过测定多肽片断氨基酸的质量来反推由什么氨基酸组成
          • 生物质谱仪
        • maldi tof ms
          • LC esi ms
      • 根据基因的核苷酸序列推定多肽的氨基酸序列
    • 肽段在原多肽链中的次序的确定（氨基酸全序列的重建）
      • 借助重叠肽
    • 二硫键位置的确定
      • 对角线电泳
        • 先部分水解
          • 带电不一样
            • 一向电泳后：含有二硫键的肽被氧化成一对含有磺基丙氨酸的肽。使得带负电。再二向电泳
• 氨基酸序列与生物进化
  • 序列的同源性，同源蛋白质和蛋白质家族
  • 同源蛋白质氨基酸序列的物种差异
  • 同源蛋白质具有共同的进化起源
• 肽和蛋白质的化学合成：固相肽合成
  • C端到N端
    • 挂接，去保护，中和，缩合，去保护，中和，缩合