第一章 细菌检验基本技术

微生物检验技术 细菌检验 微生物检验技术 细菌检验，通过观察细菌的有无动力和主要细菌群体，可了解是否为细菌性感染，有无特殊动力，并可为下一步检查选择适宜的方法和途径。

细菌检验基本技术

• 细菌形态学检查法
  • 显微镜
    • 普通光学显微镜
      • 0.2um
    • 暗视野显微镜
    • 荧光显微镜
    • 相差显微镜
    • 电子显微镜
  • 不染色标本的检查
    • 压滴法\悬滴法
    • 用于观察细菌动力及运动情况
    • 霍乱弧菌\螺旋体
  • 染色标本的检查
    • 常用染料
      • 碱性染料
        • 碱性亚甲蓝，结晶紫，碱性复红等
      • 酸性染料
        • 伊红，刚果红，酸性复红等
      • 中性染料
        • 瑞氏染液中的伊红亚甲蓝，吉姆萨染液中的伊红天青等
    • 常用的细菌染色法
      • 革兰染色
        • 最经典，最常用的染色方法
        • 初染，媒染，脱色和复染
          • 紫碘酒红
        • G+蓝紫色 G-红色
        • 临床选择用药提供参考，帮助制定有针对性的治疗方案
      • 抗酸染色
        • 细菌着色后不被盐酸乙醇脱色的染色方法， 将细菌分为抗酸性和非抗酸性
        • 抗酸菌-红色 非抗酸菌-兰色
          • 红酒美兰
        • 只针对性用于结核病，麻风病等疾病的细菌检查
      • 荧光染色
        • 敏感性强，效率高，易于观察
        • 主要用于结核分枝杆菌，麻风分枝杆菌，白喉棒状杆菌，痢疾志贺菌等检测
      • 负染色
        • 使标本背景着色而细菌不着色
        • 常用染液有墨汁，也可用酸性染料如刚果红。水溶性苯胺黑等
      • 特殊染色
        • 细胞壁染色，荚膜染色，芽孢染色，鞭毛染色，异染颗粒染色
• 细菌的培养与分离技术
  • 基本概念
    • 细菌培养：用人工方法提供细菌生长繁殖所需的营养和最适生长条件，如温度湿度气体环境，使细菌迅速生长繁殖
    • 细菌分离技术：将临床标本或其他培养物中存在的多种细菌通过一定形式分开，形成由一个细菌繁殖而来的肉眼可见的细菌集落即菌落，供鉴定研究
  • 培养基
    • 主要成分及其作用
      • 营养物质
        • 蛋白胨
        • 肉浸液
        • 牛肉膏
        • 糖（醇）类
        • 血液
        • 鸡蛋与动物血清
          • 鸡蛋培养基-结核分枝杆菌
          • 吕氏血清斜面-白喉棒状杆菌
        • 无机盐
        • 生长因子
          • 流感嗜血杆菌-X因子\V因子
      • 水
      • 凝固物质
      • 抑制剂
      • 指示剂
    • 分类
      • 按用途
        • 基础培养基
          • 肉浸液、普通琼脂平板等
        • 营养培养基
          • 血琼脂平板
          • 巧克力平板-肺炎链球菌、脑膜炎球菌、淋球菌
        • 选择培养基
          • SS琼脂平板
        • 鉴别培养基
          • 糖发酵管、克氏双糖铁琼脂
          • SS琼脂平板-利于沙门菌、志贺菌的培养
          • 麦康凯琼脂平板(MAC)-沙门无色菌落、大肠桃红色菌落
          • 抑制阳性菌生长
          • 中国蓝-酸性变蓝、中性碱性变红
          • 伊红亚甲蓝琼脂平板（EMB)-利于大肠杆菌的培养
        • 特殊培养基
          • 厌氧培养基、细菌L型培养基
      • 按物理性状
        • 液体
          • 肉汤
          • 常用于增菌培养、接种纯种细菌观察细菌生长现象
        • 半固体
          • 多用于观察细菌的动力、保存菌种
        • 固体
          • 制成平板，多用于微生物的分离纯化、鉴定及药敏试验等
          • 制成斜面或高层用于鉴定及菌种的短期保存
    • 制备
      • 调配
      • 溶解
      • 校正PH
        • 用PH比色计或精密PH纸进行校正，一般调至7.2~7.6
        • 用NaOH校正，高压灭菌后PH下降0.1~0.2
        • 用Na2CO3校正，高压灭菌后PH升高0.1~0.2
      • 分装
        • 液体培养基：分装量为试管长度的1/4~1/3，灭菌后直立待用
        • 半固体培养基：分装量约为试管长度的1/3，灭菌后直立凝固待用
        • 琼脂斜面：通常在溶解后分装于试管，加塞灭菌后趁热摆放成斜面，斜面长度约为试管长度的2/3
        • 琼脂高层：分装量约为试管长度的1/3，灭菌后直立凝固待用
        • 琼脂平板
      • 灭菌
        • 高压蒸汽灭菌法
        • 间歇蒸汽灭菌法
        • 过滤除菌法
        • 血清凝固器灭菌法
      • 质量检验
      • 保存
  • 细菌的人工培养
    • 无菌技术
    • 细菌接种与分离方法
      • 平板划线法
      • 琼脂斜面接种法
      • 液体接种法
      • 穿刺接种法
      • 涂布接种法
        • 多用于药物敏感试验
      • 倾注平板法
        • 厌氧菌兼性厌氧菌的稀释培养
    • 细菌培养方法
      • 需氧培养法
      • CO2培养法
      • 微需氧培养法
        • 5%O2 10%CO2 85%N2
      • 厌氧培养法
    • 生长现象
      • 固体
        • 细菌菌落的描述
          • 光滑型S、粗糙型R、黏液型M
        • 与鉴定细菌有关的菌落特征
      • 液体
        • 混浊生长、沉淀生长、表面生长
      • 半固体
        • 穿刺线两侧见羽毛状或云雾状浑浊生长为动力试验阳性
    • 培养基的选择
      • 血琼脂平板
        • 适用于各类细菌生长
      • 巧克力色琼脂平板
        • 含有V因子和X因子，适于含有奈瑟菌属、嗜血杆菌属细菌标本的接种
      • 肠道选择培养基
        • 中国蓝琼脂平板、EMB琼脂平板、MAC琼脂平板、SS琼脂平板
      • 血液增菌培养基
        • 用于对血液、骨髓及无菌体液标本增菌培养
      • 碱性琼脂或TCBS琼脂
        • 用于从粪便中分离霍乱弧菌及其他弧菌
      • 临床应用
        • 痰标本：血 巧 中
        • 脑脊液：血 巧 中
        • 生殖道：血 巧 中
        • 尿液：血 中
        • 脓液：血 中
        • 粪便：ss 中
• 细菌非培养检验技术
  • 免疫学检验技术
  • 分子生物化学检验技术
  • 细菌毒素检验技术
  • 降钙素原检验技术
    • 正常人＜0.1ng/ml
  • 动物实验
• 细菌的耐药性
  • 抗菌药物的概念
    • 1.抗菌药物：指对病原菌具有抑制或杀灭作用、用于预防和治疗细菌性感染的药 物，包括抗生素和化学合成的药物。
    • 2.抗生素：抗生素分子量小，低浓度就能发挥其生物活性，有天然和人工半合成两 类。
  • 抗菌药物的种类及其作用机制
    • 抗菌药物的种类
      • 按化学结构和性质分类
        • 1. β-内酰胺类：化学结构中含β-内酰胺环结构
          • 青霉素类：青霉素G、甲氧西林等。
          • 头孢菌素类：头孢唑啉等。
            • 阳球菌一代头孢最有效
            • 阴杆菌三代头孢最有效
          • 头霉素：如头孢西丁。
          • 单环β-内酰胺类：如氨曲南。
          • 碳青霉素烯类：亚胺培南与西司他丁合用称泰能。
            • 目前抗菌谱最广的药物
          • β-内酰胺酶抑制剂：如舒巴坦、棒酸使酶失活。
        • 2. 大环内酯类
          • 红霉素、螺旋霉素等
            • 衣原体、支原体、军团菌
        • 3. 氨基糖苷类
          • 链霉素、庆大霉素
        • 4. 四环素类
          • 四环素、强力霉素等
        • 5. 氯霉素类
          • 氯霉素、甲砜霉素
        • 6. 化学合成的抗菌药物
          • 磺胺类：磺胺嘧啶、复方新诺明等。
          • 喹诺酮类：包括左氧氟沙星、环丙沙星等。
        • 7. 其他
          • 抗结核药物：利福平、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺等。
          • 多肽类抗生素：多粘菌素类（抗G-最后防线）、万古霉素（抗G+最后防线）、 杆菌肽、林可霉素和克林霉素等。
      • 按生物来源分类
        • 1. 细菌：如多粘菌素（抗G-最后防线）和杆菌肽。
        • 2. 真菌：如青霉素及头孢菌素
        • 3. 放线菌：是生产抗生素的主要来源
        • 4. 植物来源的抗菌药物
    • 抗菌药物的作用机制
      • 干扰细胞壁合成
      • 损伤细胞膜功能
      • 抑制蛋白质合成
      • 影响核酸和叶酸代谢
  • 抗菌药物敏感试验
    • 概念
      • 最低抑菌浓度（MIC）：在体外培养细菌18-24h后能抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度
      • 最低杀菌浓度（MBC）：杀灭培养基内细菌或使细菌数减少99.9%的最低药物浓度
    • 药物选择
      • A组，包括对特定菌群的常规试验并常规报告的药物
      • B组，包括一些临床上重要的，特别是针对医院内感染的药物，选择性地报告
      • C组,包括一些替代性或补 充性的抗菌药物，在A、B组过敏或耐药时选用
      • U组，仅用于治疗泌尿道感染的抗菌药物
      • O组，对该组细菌有临床适应证但一般不允许常规试验并报告的药物
      • Inv 组:目前正在进行抗菌活性评估，还未被FDA批准。
    • 稀释法
      • 培养基选择
      • 药物稀释
        • 敏感S中介I耐药R
      • 菌种接种
        • 0.5麦氏标准菌液
      • 结果判读
    • 纸片扩散法
      • 药物纸片：直径6.35mm 厚度1mm 吸水量20ul
      • 培养基选择
        • M-H培养基是标准培养基
        • 琼脂厚度4+-0.5mm
        • 其他营养物质
          • 链球菌 肠球菌 脑膜奈瑟球菌 5%脱纤维羊血
          • 嗜血杆菌 VX因子
    • 联合药敏试验
      • 无关 拮抗 累加 协同
  • 细菌的耐药机制
    • 细菌耐药性的概念
      • 细菌耐药性（drug resistance）：亦称抗药性，是指细菌对某抗菌药物（抗生素或 消毒剂）的相对抵抗性。
      • 耐药性的程度：用某药物对细菌的最小抑菌浓度（MIC）表示。临床上有效药物治 疗剂量在血清中浓度大于最小抑菌浓度称为敏感，反之称为耐药。
    • 细菌耐药性的遗传机制
      • 固有耐药（intrinsic resistance）
        • 对某些抗菌药物的天然不敏感，亦称天然耐药性细菌；
        • 耐药基因来自亲代，由染色体基因决定，有种属特异性。
        • 如：G-杆菌多耐万古霉素；肠球菌耐头孢菌素等；
      • 获得耐药（acquired resistance）
        • 获得耐药性基因突变类型有基 因突变和基因转移（主要原因）
        • 由基因改变导致，耐药基因来源于基因突变或获得新基因
        • 途径：接合、转导或转化
        • 可发生于染色体DNA、质粒（最常见）、转座子等结构基因,也可发生于某些调节基因
        • 由敏感®耐药——获得耐药性与固有耐药性的重要区别
        • 大多由质粒介导，但亦可由染色体介导，如金葡菌对青霉素的耐药
        • 影响获得耐药性发生率有三个因素
          • 药物使用的剂量
          • 细菌耐药的自发突变率
          • 耐药基因的转移状况
      • 多重耐药性
        • 多重耐药性：同一微生物对三类或以上的抗生素耐药
        • 交叉耐药性
        • 泛耐药菌：指对除多黏菌素外的所有临床上可获得的抗生素菌耐药
    • 细菌耐药性的生化机制
      • 产生药物灭活酶
        • 钝化酶的
          • 具有破坏或灭活抗菌药物活性的某种酶，它通过水解或修饰作用破坏抗生素的结构使其失去活性，如分解青霉素的酶。
          • β-内酰胺酶：在G－杆菌中主要有两种：超广谱β-内酰胺酶和AmpC β-内酰胺酶。
            • 特异性水解打开药物分子结构中的β-内酰胺环，使其完全失去抗菌活性，又称灭活酶，由染色体和质粒介导。分青霉素型水解青霉素类；头孢菌素型水解头孢类和青霉素类。
          • 氨基糖苷类钝化酶：由质粒编码
            • 羟基磷酸化、氨基乙酰化或羧基腺苷酰化修饰；改变药物的分子结构
          • 氯霉素乙酰转移酶： 由质粒编码
            • 使氯霉素乙酰化而失去抗菌活性。
        • 水解酶
        • 修饰酶
      • 药物作用靶位的改变——抗菌药不易与细菌结合
        • 导致与抗生素结合的有效部位发生变异，影响药物的结合，对抗生素不再敏感，但细菌的生理功能却正常
      • 抗菌药物的渗透障碍——药物不易进入菌体内
        • 细菌细胞壁的障碍和/或外膜通透性的改变将严重影响抗生素进入细菌内部到达作用靶位发挥抗菌效能，耐药屏蔽也是耐药的一种机制。
      • 主动外排机制——药物被泵出菌体外
      • 生物被膜（biofilm，BF）
        • 细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。
        • 1.物理屏障作用
        • 2.BF内细菌处于低代谢水平，对抗生素敏感性下降
        • 3.BF内部堆积相对较高浓度的抗生素钝化酶
      • 细菌自身代谢状态改变等
        • 如呈休眠状态的细菌或细菌营养缺陷菌均可出现对多种抗生素耐药
  • 细菌耐药性的防治原则
    • 1.合理使用抗菌药物
    • 2.严格执行消毒隔离制度
    • 3.加强药政管理
    • 4.研发新抗菌药物
    • 5.破坏耐药基因
• 细菌的生化鉴定技术
  • 碳水化合物代谢试验
    • 糖（醇、苷）类发酵实验
    • 氧化-发酵试验O-F试验
      • 肠杆菌科通常为发酵型-无氧酵解
      • 非发酵型通常为氧化性和产碱型
    • β-半乳糖苷酶试验ONPG试验
    • 七叶苷水解试验
    • 甲基红（MR）试验
      • PH＜4.5 红色 + ＞6.2黄色-
      • 鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌
    • V-P试验
  • 蛋白质和氨基酸代谢试验
    • 吲哚试验
    • 硫化氢试验
    • 尿素酶试验
    • 苯丙氨酸脱氨酶试验
    • 氨基酸脱羧酶试验
  • 碳源利用试验
    • 枸橼酸盐利用试验
    • 丙二酸盐利用试验
    • 醋酸盐利用试验
    • 马尿酸盐水解试验
    • 乙酰胺利用试验
  • 呼吸酶类试验
    • 氧化酶试验
      • 盐酸二甲基对苯二胺-紫红色
      • 盐酸四甲基对苯二胺-蓝色
      • 鉴别肠杆菌-和非发酵菌+
    • 过氧化氢酶（触酶）试验
      • 3%过氧化氢
      • G+初步鉴定
        • 葡萄球菌 微球菌+
        • 链球菌 --
    • 硝酸盐还原试验
  • 其他生化或鉴定细菌常用试验
    • 凝固酶试验
    • 卵磷脂酶试验
    • DNA酶试验
    • 胆汁溶菌试验
    • CAMP试验
    • 氢氧化钾拉丝实验
    • 杆菌肽试验
    • 奥普托欣试验
    • O/129抑菌试验
  • 复合生化试验
    • 克氏双糖铁试验
      • 葡萄糖：乳糖 1：10
    • 动力-靛基质-尿素酶试验MIU
      • 动力 吲哚 脲酶
    • IMViC
      • 吲哚 甲基红 VP 枸橼酸盐