导图社区 生物化学 蛋白质
这是一篇关于生物化学蛋白质的思维导图。蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。
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蛋白质
分子组成
C，H，O，N，S
各种蛋白质含N量接近，平均为16%
体内含N物质以蛋白质为主 测定生物样品含氮量可大致推算蛋白质含量 公式P8
有些蛋白质含少量磷或金属元素，个别含碘
氨基酸
自然界中AA有300余种，组成人体蛋白质的只有20种，除Gly均属于L-α氨基酸（严格来说，Pro属于L-α亚氨基酸）
天然蛋白质中不存在瓜氨酸、鸟氨酸、精氨酸代琥珀酸，硒代半胱氨酸存在于少数天然蛋白质中
胱氨酸参与组成人体蛋白质，同型半胱氨酸则不参与组成人体蛋白质
分类
非极性的脂肪族AA
极性中性AA
芳香族AA
酸性AA
碱性AA
理化性质
1. 两性解离：两性电解质，解离程度取决于酸碱度
等电点
2. 含共轭双键的氨基酸（Y、W）具紫外线吸收性质
分析蛋白质含量
3. 氨基酸+茚三酮--->蓝紫色化合物
氨基酸定量分析
弱酸性条件，氨基酸氧化脱氨脱羧，茚三酮水合物被还原，可与氨结合，再与另一分子茚三酮缩合形成蓝紫色化合物（最大吸收峰：570nm，峰值含量与氨基酸脱氨量成正比）
重要AA
必需氨基酸：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、组氨酸
亚氨基酸：Pro、羟脯氨酸
含胍基的氨基酸：Arg
杂环氨基酸：咪唑基-杂环氨基酸：Pro、His 吲哚环-杂环氨基酸：Trp
含酰氨基氨基酸：Asn、Gln
含硫氨基酸：Met、Cys（含巯基）
极性最强（还原性强）AA：Cys
有胱氨酸则有Cys，胱氨酸不组成人体蛋白质，人体蛋白质中有胱氨酸
含支链氨基酸
Val、Leu、Ile
含羟基氨基酸
Ser、Thr、Tyr·
肽
寡肽
2~20AA
多肽
21~50AA
概念
肽键
肽键都是酰胺键，酰胺键不是肽键
N端、C端
氨基酸残基
重要生物活性肽
谷胱甘肽GSH
组成
Glu、Cys、Gly
非α-肽键、功能基团
功能
还原剂
保护蛋白质/酶分子巯基免遭氧化，使蛋白质或酶处在活性状态
GSH过氧化物酶催化下，可还原细胞产生的H2O2（GSH被氧化为氧化型GSH）
嗜核特性
解毒，阻断嗜电子毒物如致癌剂或药物等结合DNA、RNA或蛋白质
抗新陈代谢（抗衰老）
应用
减少放疗、化疗毒性，护肝，解毒等
多肽类激素及神经肽体
1.有许多激素属寡肽/多肽，如：催产素、加压素、促肾上腺皮质激素、促甲状腺素释放激素等 2.神经肽
蛋白质分子结构
一级结构
定义
N端至C端
稳定因素
肽键（主）、二硫键
意义
1. 一级结构是空间构象的基础
2. 一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能
3. 氨基酸序列提供重要的生物进化信息
4. 重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病
分子病
二级结构
一段肽链，主链骨架原子
氢键
结构单位
肽单元
共平面
反式结构
不能自由旋转
形式
α-螺旋（最常见）
右手螺旋
侧链向外
3.6AA残基/圈，螺距0.54nm
两亲特点
血浆脂蛋白、钙调蛋白激酶、多肽激素等
可缠绕
增加机械强度
可伸缩
β-折叠（片层结构）
锯齿状
侧链交替位于上下方
5~8AA残基
平行同/反向排列
与α-螺旋并存
β-转角（球状蛋白质中）
180°回折转角
4AA残基（I型：第二个常为Pro，II型：第三个常为Gly）
类型
Ω环（球状蛋白质中）
形状
表面
亲水AA为主
可能在分子识别中起作用
形成原因
氨基酸残基侧链影响二级结构的形成 二级结构以一级结构为基础
氨基酸残基之间斥力大（同电荷、体积大且距离接近、无法形成氢键）--->不易形成α-螺旋
Pro破坏α-螺旋 多个酸/碱性氨基酸相邻破坏α-螺旋 Thr、Cys、Asn侧链较大
氨基酸残基侧链过大--->不易形成β-折叠
三级结构
整条肽链，所有氨基酸残基（所有原子）
次级键：疏水键、氢键、离子键、范德华力等
特征
1. 折叠成紧密球状或椭圆状
2. 含有多种二级结构并具有明显的折叠层次
3. 疏水侧链常分布在分子内部
结构模体
模体是具有特殊功能的超二级结构（模体是二级结构）
许多蛋白质分子中可以有二个或三个具有二级结构的肽段，在空间位置上相互接近，形成特殊的空间结构，称其为“模体”
组成、特点
≥2个二级结构的肽段
具特定空间结构、特定功能
常见形式
举例
亮氨酸拉链、钙离子结合蛋白（螺旋-环-螺旋，结合钙离子的模体）、纤连蛋白结合肽、锌指结构等
超二级结构
二级结构组合
二级结构组合形式主要有3种：αα，βαβ，ββ 各二级结构之间相互作用主要通过非极性氨基酸残基形成
结构域
三级结构层次、独立结构和功能
特点
限制酶水解，可被独立分解出，构象和功能保持，超二级结构不具备此特点 可看作球状蛋白质的独立折叠单位，有较为独立的三维空间结构
分子伴侣
辅助蛋白质折叠成正确空间构象
热休克蛋白（Hsp）、伴侣蛋白、核质蛋白等
肌红蛋白
153AA、单一肽链、球状分子
α-螺旋占75%（A~H螺旋区）、两螺旋区之间有柔性连接肽（Pro位于转角）
表面主要有亲水侧链，疏水侧链位于分子内部
储存O2
四级结构
亚基空间排布，亚基接触部位、相互作用
亚基
完整三级结构的多肽链
同二聚体、异二聚体
结合力
氢键、离子键
高级结构/空间构象
蛋白质分类
根据组成
单纯蛋白质
只含AA
缀合蛋白质
蛋白质部分+非蛋白质部分（辅基）
根据形状
纤维状蛋白质
球状蛋白质
蛋白质家族
氨基酸序列、空间结构、功能相似
同源蛋白质
同一蛋白质家族的成员
超家族
氨基酸序列不相似，含发挥相似作用的同一模体结构
主要功能
1. 构成细胞和生物体结构
2. 物质运输
3. 催化功能
4. 信息交流
5. 免疫功能
6. 氧化供能
7. 维持机体的酸碱平衡
8. 维持正常的血浆渗透压
执行功能主要方式
蛋白质与小分子
蛋白质与小分子代谢物相互作用，参与酶催化、物质运输、信息交流等生命过程，整体上维持生物体新陈代谢活动进行
蛋白质与核酸
基因表达产生蛋白质，蛋白质辅助基因表达
举例（RNA-蛋白质复合体）
核糖体
端粒酶
剪接体
蛋白质之间（主要方式）
非共价键相互作用
主要组织相容性复合物MHC参与的分子识别
MHC
I型
本质
跨膜蛋白
结构
α链
4区
β2m
不与细胞直接相连，与α链在胞外部分以非共价键结合
功能（Tc杀伤）
Tc细胞表面CD8协助TCR识别MHC I-免疫原性多肽复合物
TCR特异性结合MHC I（次级键），接受抗原肽
Tc大量增殖，之后释放穿孔素、颗粒酶，靶细胞凋亡
II型
抗原抗体特异性结合
免疫球蛋白
具有抗体活性的蛋白质
分布
血浆、其他体液、组织和一些分泌液中
产生
浆细胞
结合抗原形成抗原-抗体复合物，激活补体系统
可变区V区
N端起，H链1/4，L链1/2
决定不同Ig与抗原结合的特异性
恒定区C区
决定Ig的效应作用，是Ig的分类基础（5类）
IgG、D、E
四聚体
IgA
二聚体
IgM
五聚体 （最大，970kD，巨球蛋白）
共性
重链（H链）×2 （5类）
可变区VH
恒定区CH
CH1
CH2
含补体结合部位
CH3
含与中性粒细胞、巨噬细胞受体接触部位
轻链（L链）×2 （2类）
可变区VL
恒定区CL
L、H链可变区形成高变区——抗原结合部位 L和H链之间、L链之间、H链之间二硫键连接
特异结合
抗原决定簇（抗原表位）+抗体超变区中沟槽分子表面的抗原结合点——空间结构上互补
高亲和性结合位点空间构型上非常适合，结合牢固，不易解离 低亲和性结合位点较易解离
低pH、高浓度盐、反复冻融等，导致抗原抗体解离后，抗原抗体保持原有结构、活性、特异性
天然抗原表面带有多种抗原表位，一个抗原分子可刺激机体产生多种特异性抗体
蛋白质一级结构与高级结构
一级结构是空间构象的基础
蛋白质空间构象遭破坏，只要保留一级结构，仍可能回复至原来的三级结构
牛核糖核酸酶A实验（尿素、β-巯基乙醇，分别破坏次级键、二硫键）
一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能
由同一基因进化而来的相关基因所表达的一类蛋白质
人类20%~30%蛋白质具多态性
人类群体中不同个体间，这些蛋白质存在氨基酸序列的多样性，但几乎不影响蛋白质的功能
不同哺乳动物胰岛素分子
氨基酸序列提供重要的生物进化信息
通过比较一些广泛存在于生物界不同种系间的蛋白质的一级结构，可以帮助了解物种进化关系
细胞色素c（cyt c）
重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病
基因突变所致，蛋白质分子发生变异导致的疾病
举例：镰状细胞贫血（Hb的β亚基 N端第６个AA，谷氨酸--->缬氨酸）（脆性高，携氧能力弱） 肌营养不良（基因大片段碱基缺失导致大片段肽链的缺失）
蛋白质功能依赖特定空间结构
血红蛋白亚基与肌红蛋白结构类似
血红素
4个次甲基连4个吡咯环，Fe2+位居环中
肌红蛋白Mb
α-螺旋占75%（A~H螺旋区）、两螺旋区之间有柔性连接肽
疏水侧链在内，富极性、电荷的侧链在外——水溶性好
内部有一个袋形空穴，血红素位居其中
F8组氨基酸残基与Fe2+形成配位结合
氧解离曲线：直角双曲线
血红蛋白Hb
4个亚基组成的四级结构、亲水球状（8对盐键使4亚基紧密结合，各亚基基本结构与Mb类似）
每个亚基中间有一个疏水局部，可结合1个血红素、携带1分子氧，1分子Hb可以结合4分子O2
成年人：α2β2、α2δ2（较少）；胎儿期：α2γ2；胚胎期：α2ε2；镰状细胞贫血病人：α2S2
氧解离曲线：S形曲线
血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合
Hb、Mb可以可逆地与O2结合，氧合Hb占总Hb的百分数（称为百分饱和度）随O2浓度变化而变化
HbO2呈鲜红色，去氧Hb呈紫蓝色
血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动
（正/负）协同效应
一个寡聚体蛋白质中，一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一亚基与配体的结合能力
紧张态T态
疏松态R肽
别构效应
蛋白质（或亚基）因与某小分子物质相互作用而发生构象变化，导致蛋白质（或亚基）功能的变化，成为蛋白质的别构效应
相当于协同效应
蛋白质构象改变可引起疾病
蛋白质构象疾病
有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。
举例：人纹状体脊髓变性病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、疯牛病
疯牛病
朊病毒蛋白（PrP）引起的神经退行性病变
PrP由富含α-螺旋变为富含β-折叠，变得不易水解，且热稳定，容易形成淀粉样纤维沉淀
蛋白质理化性质
1. 两性电离
等电点PI（多接近5.0，人体蛋白质多为阴离子）
酸性蛋白质：胃蛋白酶、丝蛋白
碱性蛋白质：鱼精蛋白、组蛋白
2. 紫外光谱区有特征性光吸收
Tyr、Trp，280nm，A280nm与浓度成正比--->定量测定蛋白质含量
3. 呈色反应测定溶液中蛋白质含量
茚三酮反应
弱酸溶液、氨基酸+茚三酮水合物--->蓝紫色化合物
形成的蓝紫色化合物在570nm处有最大吸收，氨越多，色越深
双缩脲反应
稀碱溶液、肽键+硫酸铜共热--->紫色/红色
检测蛋白质水解程度（水解程度↑颜色越浅）
酚试剂/改良Lowery试剂测定蛋白质含量
4. 胶体性质
水化膜（防止聚集沉淀）、表面电荷（稳定胶粒）
5. 变性与复性
蛋白质变性
物理、化学，空间结构，有序--->无序，理化性质、生物学活性
因素
加热、强酸、强碱、有机溶剂、重金属离子、生物碱试剂
被破坏的化学键
二硫键、非共价键
1. 溶解度降低
2. 黏度增加
3. 结晶能力消失
4. 生物学活性丧失
5. 易受蛋白酶水解
6. 疏水基团暴露，更易聚集沉淀
蛋白质沉淀
蛋白质沉淀不一定变性，蛋白质变性更容易沉淀
蛋白质复性
恢复或部分恢复
不可逆变性
蛋白质的凝固作用
利用高温、高压、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子、生物碱试剂等因素消毒、灭菌
稳定剂、低温储存防止变性
蛋白质的分离纯化与结构分析
蛋白质的分离纯化
丙酮/乙醇沉淀
丙酮、乙醇等有机溶剂可以使蛋白质沉淀，再将其溶解在小体积溶剂中即可获得浓缩的蛋白质溶液
为保持蛋白质的结构和生物活性，需要在0～4℃低温下进行丙酮或乙醇沉淀
沉淀后应立即分离，否则蛋白质会发生变性
盐析
将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀
各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH均不同，可据此将不同的蛋白质予以分离
免疫沉淀
利用特异抗体可以识别相应抗原并形成抗原抗体复合物的特性，可从蛋白质混合溶液中分离获得相应的抗原蛋白
去除蛋白质溶液中的小分子化合物
透析
利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法
超滤法
应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的
利用荷电性质可电泳分离不同带电量蛋白质
电泳法
蛋白质在高于或低于其PI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
等电聚焦电泳
双向凝胶电泳
层析法、凝胶法按蛋白质分子量大小分离
层析法
又称色谱法，是根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的
离子交换层析
凝胶过滤/分子筛层析
大分子快，小分子慢
亲和层析
超速离心
既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量
沉降系数
蛋白质在离心场中的行为用沉降系数表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关
