核酸的生物合成

考研414统考生物化学，核酸人工合成，以核苷或单核苷酸为原料，采用有机合成反应或酶促合成反应进行的寡核苷酸或核酸（DNA和RNA）大分子的合成。

核酸的生物合成

• 中心法则
  • 生物通过DNA复制使遗传信息从亲代传给子代，通过以DNA为模板合成RNA的转录过程，以及以RNA为模板，合成蛋白质的翻译过程，使遗传信息在个体中得以表达
  • 对于以RNA为遗传物质的生物体，其RNA可自我复制，也可以以RNA为模板进行逆转录（H.Temin、D.Baltimore证明其酶），使遗传信息在亲代和子代之间传递。RNA复制和逆转录过程使中心法则得以补充和完善
• DNA的生物合成
  • DNA复制特点（3点）
    • 半保留复制
    • 合成方向是5’→3’
    • 半不连续性
      • 先导链为连续合成，后随链为不连续合成
  • 原核生物DNA的复制
    • DNA复制体系（大肠杆菌）
      • 拓扑异构酶和解旋酶
        • 拓扑异构酶Ⅱ（与Ⅰ作用相反）
          • 引入负超螺旋，成功解链
        • 解旋酶
          • 解开DNA双螺旋
      • 单链DNA结合蛋白（SSB）
        • 防单链复性成双链
      • 引物酶与引发体（引物）
        • RNA引物的3’-OH与DNA复制时第一个脱氧核苷酸在DNA聚合酶催化下形成3’，5’-磷酸二酯键
      • DNA聚合酶
        • DNA聚合酶Ⅲ
          • 复制
          • 10种亚基，α、ε、θ组成核心酶单体，其中ε亚基具有3’→5’核酸外切酶活性，保证DNA合成的忠实性
        • DNA聚合酶Ⅰ
          • 修复，也参与复制
          • C端大片段（Klenow片段）
            • 5’→3’方向的聚合酶活性和3’→5’方向的核酸外切酶活性
          • N端小片段
            • 5’→3’方向的核酸外切酶活性
            • 负责RNA引物的切除和引物切除后空隙的填补
        • DNA聚合酶Ⅱ
          • 损伤DNA的修复
        • DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ
          • 参与SOS修复
      • DNA连接酶
        • 聚合后质检
        • 大肠杆菌利用NAD+作为辅因子，而真核生物利用ATP作为辅因子
    • DNA合成过程中各个酶的作用
      • DNA促旋酶（拓扑异构酶Ⅱ）
        • 打开DNA超螺旋
      • DNA解旋酶（Dna B）
        • 5’→3’解开DNA双链
      • Dna C
        • Dna B的载体，帮助Dna B和DNA结合
      • Dna A
        • 复制起始因子，与DNA复制起点结合
      • DNA单链结合蛋白（SSB）
        • 与解旋后的DNA单链结合，稳定DNA单链
      • 引物酶（Dna G）
        • 合成一小段RNA引物
      • DNA聚合酶Ⅲ（复制）
        • 原核生物DNA聚合酶Ⅲ具有10个亚基，其中αεθ是核心酶，具有聚合活性和外切活性（5’→3’聚合活性，3’→5’外切活性）
        • DNA前导链和后随链合成中重要作用
      • DNA聚合酶Ⅰ（修复）
        • 大片段：5’→3’聚合活性，3’→5’外切活性
        • 小片段：5’→3’外切活性
        • 引物的切除以及DNA链空缺的合成
      • DNA连接酶（质检）
        • 连接单链DNA上的缺口
      • Tus蛋白
        • 与DNA复制终止有关
    • 过程（3个阶段）
      • 起始
        • 复制起点（“ori”）开始
          • 大肠杆菌中为oriC，多种蛋白质作用下解链
      • 延伸
        • 前导链（5’→3’合成，其模板链方向3’→5’）连续合成，后随链（5’→3’合成，其模板链方向3’→5’）不连续合成（产生冈崎片段，由DNA连接酶连接）
      • 终止
        • DNA聚合酶遇到DNA复制终止序列，在Tus蛋白帮助下复制终止
    • DNA复制准确性原因（5点）
      • 核糖核苷二磷酸还原酶的调节作用。维持dNTP均衡，大大降低掺入错误
      • DNA聚合酶的构象变化。dNTP与模板正确匹配后，诱导DNA聚合酶从开放构象转化为关闭构象，催化聚合反应，检验掺入正确性
      • DNA聚合酶Ⅰ和DNA聚合酶Ⅲ的3’→5’的核酸外切酶活性。合成新链的同时，可切除错误掺入的dNTP
      • 借助RNA引物。复制开始时易错配，合成初借助RNA引物，合成后切除RNA引物，避免易产生的错误
      • 修复酶的作用。细菌细胞中还存在一系列修复酶，可修复DNA复制错误及损伤的DNA
  • 真核生物DNA的合成
    • 真核生物DNA复制特点（5点）
      • 5种DNA聚合酶
      • DNA复制包括多个复制子
      • DNA复制起始复合物的组装和激活分属于不同细胞周期
      • RNase1和Flap内切酶-1参与真核生物DNA复制过程中引物的切除
      • 染色体DNA复制起始和终止序列
    • 原核生物和真核生物DNA复制的区别（3点）
      • 真核生物DNA复制为多起点双向复制，原核生物为单一起点（“ori”）双向或者单项复制
      • 真核生物DNA复制的冈崎片段长度100－200个核苷酸，原核生物为1000－2000个核苷酸
      • 真核生物DNA复制的各复制子在全部染色体复制完成恰不能重新复制
  • 逆转录
    • H.Temin和D.Balimore证实了逆转录酶的存在
    • 功能
      • 依赖RNA的DNA聚合酶活性（终产物DNA）
      • 核糖核酸酶H的活性
      • DNA指导的DNA聚合酶活性（DNA是双链的）
    • 逆转录现象的生物学意义（3点）
      • 丰富中心法则
      • 拓宽RNA病毒致病机理的相关研究
      • 在生物技术和分子生物学研究中，作为体外获得cDNA的重要、常用方法
  • DNA的损伤修复及突变
    • 直接修复
      • 碱基由受损到正常
    • 切除修复
      • 酶作用下DNA损伤部位能被直接切除，由互补链作模板链互补修复
    • 错配修复
      • 大肠杆菌对DNA复制完成后出现的碱基错配进行的修复
        • 区分模板链和新链
          • 模板链GATC中A是甲基化标记（N6位甲基化）
    • 重组修复
      • 复制后修复
        • 子代从母链上获取片段修复，母链由复制酶以互补链为模板合成
    • SOS反应与易错修复
      • DNA严重损伤时启动，错误多准确性差
    • 突变
      • 核苷酸替换点突变
      • DNA片段插入和缺失突变
      • 诱变剂
        • 物理
          • 紫外线
          • X射线
        • 化学
          • 亚硝酸
          • 烷基化试剂
        • 生物
  • PCR技术
    • Kary Mulis发明的体外人工合成DNA方法
      • 重组DNA技术获得目的基因
    • 反应体系
      • DNA模板
      • 一对引物
      • dNTP
      • DNA聚合酶
    • 反应周期
      • 高温变性
      • 低温退火
      • 适温延伸
• RNA的生物合成
  • RNA的转录及转录后加工
    • 真核生物三种RNA聚合酶对应的转录产物
      • RNA聚合酶Ⅰ
        • 核仁
          • 转录28S、18S、5.8S rRNA
      • RNA聚合酶Ⅱ
        • 核质
          • 转录mRNA
      • RNA聚合酶Ⅲ
        • 核质
          • 转录tRNA和5SrRNA
    • 转录过程
      • 真核生物转录起始前有个装配过程
      • 真核生物由转录因子识别启动子
      • RNA聚合酶在转录过程中发生磷酸化修饰
    • RNA转录的全酶、核心酶
      • 全酶
        • α2ββ′ωσ
      • 核心酶
        • α2ββ′ω
      • σ亚基的功能
        • 与启动子DNA序列结合，促进转录开始
    • 原核生物启动子（两段）
      • TTGACA（-35区）
      • TATAAT（-10区）
    • 大肠杆菌转录的起始过程（三步骤）——转录限速步骤
      • 启动子的寻找
      • 复合物构象变化
      • 启动子清除
    • 大肠杆菌转录的终止方式
      • 不依赖ρ因子的终止
        • 富含GC序列
      • 依赖ρ因子的终止
        • ρ因子功能
          • ATP酶活性和RNA-DNA解旋酶活性
        • 需要辅助蛋白质NusA
    • RNA的转录后加工
      • 原核生物（大肠杆菌）
        • tRNA
          • 切除多余核苷酸序列，添加所需核苷酸序列、特定碱基的共价修饰
        • rRNA
          • 初产物大小为30S，RNaseⅢ核酸内切酶作用、M16、M23、M5核酸内切酶作用形成16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA
      • 真核生物
        • tRNA
          • 剪切5'端多余序列，在3'端添加CCA
        • rRNA
          • RNA聚合酶Ⅰ作用下形成45S前体，核酸内切酶RNaseⅢ作用下形成32S、20S前体，分别产生核糖体大亚基的28SrRNA、5.8SrRNA以及小亚基的18SrRNA
          • 核糖体大亚基的5SrRNA部分并非来自45SrRNA前体，而是RNA聚合酶Ⅲ的产物
        • mRNA
          • hnRNA（mRNA前体加工过程中形成的分子大小不等的中间物）→mRNA（4步）
            • 5'端形成特殊帽子结构，即加帽（磷酸酶、甲基化酶）
            • 3′端加polyA尾巴
              • 不被核酸酶降解
            • 去除内含子
            • 链内部核苷酸甲基化修饰
  • RNA的复制
    • 以RNA为模板合成RNA
    • 正链RNA病毒
    • 负链RNA病毒
    • 双链RNA病毒
    • RNA逆转录病毒