酶工程

将载体DNA和目的基因用形成黏性末端(sticky ends) 的同一种限制性内切核酸酶进行切割，形成黏性末端按照1：1的比例混合，经过退火处理，使载体DNA与外源DNA的黏性末端结合，形成双链结合体；在T4DNA 连接酶的作用下双链结合体连接形成稳定重组DNA分子。

《蛋白质与酶工程》—第八章 酶的定向进化

• 天然酶的局限
  • 酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求
    • 稳定性差
    • 活性低使催化效率很低
    • 缺乏有商业价值的催化功能
• 酶分子定向进化的定义
  • 是模拟自然进化过程（随机变异和自然选择）,在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。
  • 一些进化的对比
    • 自然进化
      • 不可控的随机突变和重组（突变几率小) +自然界定向筛选(筛选方向由外界环境确定)
    • 人工进化
      • 人工控制的随机突变（突变几率大，但突变基因不可知） +人工定向筛选(筛选方向人工确定)
    • 定向进化
      • 人工控制的单基因突变(突变或重组基因可选定) 十人工定向筛选（筛选方向人工确定，通常用高通量筛选）
• 酶定向进化的特点
  • 适应面广
    • 广泛应用于各种蛋白质类酶(P酶)和核酸类酶(R酶)的改性
  • 目的性强
    • 进化方向明确,具有很强的目的性
  • 效果显著
    • 能在短时间内获得自然界需要长时间完成的进化。
• 酶定向进化的第一步
  • • 易错PCR技术
      • 易错PCR技术是从酶的单一基因出发，通过改变聚合酶链反应的条件，如改变底物和镁离子浓度等，在PCR扩增过程中，使碱基配对出现错误而引起基因突变
      • 易错PCR特点
        • 操作简便，随机突变丰富
        • 正突变概率低，突变基因文库较大，筛选工作量大
        • 适合较小基因(< 800bp)的定向进化
    • 基因重排技术
      • DNA重排技术是从两条以上的正突变基因出发，经过酶切和不加引物的PCR扩增，使DNA碱基序列重新排布而引起基因突变
      • DNA重排技术特点
        • 正突变体概率高，进化速度较快
        • 在获得全长基因之前要除去DNase I
    • 基因家族重排技术
      • 基因家族重排技术是从基因家族的多个同源基因出发，经过酶切和不加引物的PCR扩增等，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变
• 酶突变基因的定向选择
  • 从上述多种技术获得的各种各样突变中筛选出具有新催化特性的酶突变基因
  • • 突变基因文库的构建
      • 突变基因文库的构建是将各种不同的突变基因与载体重组,再转人适宜的细胞或包装成重组X唾菌体的技术过程
      • 构建基因文库的质量要求
        • 构建的突变基因文库必须尽可能地把各种突变基因包含在其中,并且能够完整地反映基因的结构和功能信息
          • 文库的包容性
            • 突変基因文库的包容性是指所构建的文库必须尽可能地包含基因的任何一种可能的突变信息,包括正突变、负突变和中性突变,以便进行全面的筛选。
          • 文库的完整性
            • 突变基因文库的完整性是指文库中包含的DNA片段必须尽可能完整地反映基因的结构和功能信息,以便通过締选得到的突变基因能够通过表达获得完整的具有催化功能的进化酶
      • 构建突变基因文库的主要过程
        • 载体的选择
          • 1)质粒载体
            • 质粒载体是由天然质粒经过人工改造而成的一种常用的基因克隆载体
            • 适用于构建原核生物基因文库、cDNA库和次级克隆
          • 2)噬菌体DNA载体
            • 由噬菌体DNA改造而成的具有自我复制能力的载体
            • 最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库
          • 3)黏粒载体
            • 黏粒(cosmid)是一类人工构建的含有λDNA黏端cos序列)和质粒复制子的质粒载体，又称柯斯质粒
            • 常被用来沟建高等生物基因文库
          • 4)噬菌粒载体
            • 噬菌粒(phagemid)是一类人工构建的有M13单链DNA的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因载体。
            • 它兼具丝状噬菌体与质粒载体的优点
        • 基因重组
          • 1)黏性末端连接
            • 将载体DNA和目的基因用形成黏性末端(sticky ends) 的同一种限制性内切核酸酶进行切割，形成黏性末端按照1：1的比例混合，经过退火处理，使载体DNA与外源DNA的黏性末端结合，形成双链结合体；在T4DNA 连接酶的作用下双链结合体连接形成稳定重组DNA分子
          • 2)平头末端连接
            • 有些限制性内切酶（如HPaI,Sma等）作用于DNA分子后，形成的末端是平端(blunt ends)。
            • 具有平端的质粒载体DNA和外源DNA分子，可以在T4 DNA连接酶的作用下，形成重组DNA分子
          • 3)修饰末端连接
            • 当载体DNA和外源DNA的末端不相匹配时，T4DNA连接酶无法进行连接。所以在连接之前，必须对两个末端或期中一个进行修饰处理，使两种DNA的末端互相匹配以便于连接，形成重组DNA。
        • 组装突变基因文库
          • 突变文库的组装是将重组DNA转入受体细胞或包装成有感染活性的重组噬菌体的过程。
          • 对于重组质粒载体可以通过细胞转化等方法将重DNA转入受体细胞，形成突变基因文库
          • 对于重组噬菌体DNA载体， 需要用噬菌体外壳蛋白将重组DNA进行包装，成为有感染活性的重组噬菌体而形成基因文库。
    • 突变基因的筛选
      • 突变基因文库构建好以后,就可以根据定向进化的目的要求,在一定的环境条件下进行締选,从突变基因文库中选取得到所需的突变基因。
      • 定向选择环境条件的设定
      • 高通量筛选技术
        • 1.平板筛选法
          • 将含有随机突变基因的重组细胞，涂布在平板培养基上，在一定条件下培养，依据重组菌细胞的表型鉴定出有效突变基因的筛选方法。
          • 1)依据细胞生长情况筛选突变基因
          • 2)依据颜色变化筛选突变基因
          • 3)依据透明圈情况筛选突变基因
        • 2.荧光筛选法
          • 荧光筛选法通常是将具有荧光激发特性物质的基因作为报告基因，与突变基因一起克隆到载体中，形成重组细胞，在突变基因表达的同时报告基因也进行表达，由于报告基因的表达产物可以激发荧光，所以通过检测荧光的产生情况，就可以获得能够在重组细胞中表达的突变基因
        • 3.噬菌体表面展示法
          • 利用丝状噬菌体的外膜结构蛋白与某些特定的外源蛋白或多肽分子形成稳定的复合物，使目标外源蛋白或多肽富集在噬菌体表面的一种分子展示技术
        • 4.酵母细胞表面展示法
          • 通过锚定在酵母细胞表面的特定蛋白质（凝集素蛋白、絮凝素蛋白等）与某些外源蛋白或多肽形成稳定的复合物，使这些外源蛋白或多肽富集在酵母细胞表面的一种分子展示技术
        • 5.核糖体展示技术
          • 通过PCR扩增，获得DNA突变文库，置于具有偶联转录、翻译的系统中，由于翻译到终止密码子mRNA末端后，核糖体仍停留在mRNA的3'端而不脱离，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面，形成“RNA 蛋白质一核糖体”的三元复合物，将基因型和表现型直接偶联起来，利用免疫学检测技术对复合体进行分析和筛选。
        • 6.乳液荧光
        • 7.量热筛选
• 酶定向进化的应用
  • 一、提高酶的催化效率
    • 是定向进化的主要目标之一
  • 二、增加酶的稳定性
    • 方法
      • 分子修饰
      • 固定化
      • 非水相介质催化
      • 定向进化
  • 三、改变酶的底物特异性
    • 影响酶对底物的K值，进而改变底物特异性