动植物细胞发酵产酶

酶工程（第四版） 动植物细胞发酵产酶思维导图，内容有植物细胞培养产酶、动植物细胞中酶生物合成的调节、动物细胞培养产酶。

动植物细胞发酵产酶

• 动植物细胞中酶生物合成的调节
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  • 细胞分化改变酶的生物合成
    • 端粒是真核生物染色体的末端结构 端粒酶一般存在于分化程度较低的细胞中
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  • 基因扩增加速酶的合成
    • 通过增加基因的数量调节基因表达，可以发生在个体发育某一阶段或细胞分化某一过程 基因扩增是通过从染色体切除基因的重复序列再进行染色体外复制 或通过将核糖体RNA的全部重复序列生成RNA转录物再逆转录生成原来DNA分子的额外拷贝而实现的。
  • 增强子促进酶的生物合成
    • 增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性，可高效增强某些酶基因的表达 具有细胞或组织特异性，在不同细胞或组织中增强效果不同
  • 抗原诱导抗体酶的生物合成
    • 半抗原诱导法
    • 拷贝法
    • 基因工程法
• 动物细胞培养产酶
  • 动物细胞特性
    • 动物细胞没有细胞壁，适应环境的能力差，十分脆弱
    • 动物细胞体积>微生物细胞，<植物细胞，对剪切力敏感
    • 在细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性以及功能全能性
    • 动物细胞的营养要求较复杂，必须供给各种氨基酸、维生素、激素和生长因子等。动物细胞培养基中一般需要加进5%~10%的血清
  • 动物细胞培养的特点
    • 主要用于各种功能蛋白质的生产
    • 生长较慢，细胞培养时间15~100h
    • 需要添加抗生素
    • 动物细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感
    • 大多数采用贴壁培养;部分细胞采用悬浮培养
    • 培养基成分较复杂，产物的分离纯化繁杂
    • 原代细胞继代培养50代后，即会退化死亡
  • 动物细胞培养方式
    • 悬浮培养
      • 适用于非贴壁依赖型细胞 类似于微生物细胞的深层发酵，但工艺条件有较大差别
      • 优点（相对于贴壁培养）： 细胞在培养液中均匀分散，生长情况良好 传代培养容易，无需消化分散细胞 培养基中营养成分利用率高
    • 贴壁培养
      • 适用于贴壁依赖型细胞
    • 固定化培养
      • 一般采用吸附法和包埋法
    • 动物细胞培养的工艺条件及控制
      • 种子的获得
      • 培养基
        • 氨基酸：各种必需氨基酸，Gln 等，作为碳源和能源利用（氮源） 维生素：B族和维C，可由血清提供 无机盐：调节渗透压 微量元素：Fe、Cu、Zn等，可由血清提供 葡萄糖：作为碳源和能源（易产生乳酸） 激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松等，可由血清提供 生长因子：如表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子等，一般来源于血清
      • 培养条件
        • 温度： 哺乳动物细胞培养一般控制在 36.5±0.25 oC 温度也影响 CO2 溶解度，从而影响培养液 pH 值
        • 渗透压：保持细胞内外等渗状态，一般700～850 kPa
        • 溶解氧： 供氧不足：细胞生长受抑制 过量供氧：容易产生较多氧自由基，杀伤细胞 用混合气代替空气（空气、O2、N2、CO2）
        • pH 值与 CO2 浓度： 动物细胞培养液 pH 在 7.0～7.6 之间，以 pH 7.4 为最佳 最常用的缓冲体系为 CO2 / HCO3- 动物细胞培养时缺少 CO2，培养液中的 HCO3- 会被耗尽；CO2 保持了 HCO3- 的浓度，以提供稳定的缓冲环境 通常 CO2 浓度维持在 2～10% 之间 指示剂：酚红
• 植物细胞培养产酶
  • 植物细胞的主要特点
    • 细胞大 细胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞，生长周期长 营养要求简单（较动物细胞） 细胞生长及合成次级代谢产物需要光照条件 对剪切力较敏感（较微生物） 主要用于产天然产物、色素、香精等有机物（次级代谢物）
  • 植物细胞发酵的特点
    • 提高目标物的产率 缩短生产周期 木瓜蛋白酶：木瓜生长期8个月，木瓜细胞培养约1个月 易于管理，不受自然因素控制 可以提高产物质量 通过严格的培养条件控制，减少植株病虫害和污染
    • 培养条件要求高 —— 光照、剪切力影响显著 植物细胞生长缓慢 —— 相对于微生物
  • 植物细胞发酵产酶的工艺条件控制
    • 外植体选择和处理
      • 选择：无病虫害、生长旺盛、生长有规则 切片：0.5～1 cm 消毒：70% 乙醇 5% 次氯酸钠 / 10% 漂白粉 0.01～0.1% HgCl2
    • 获取植物细胞
      • 直接分离
        • 机械法：将外植体捣碎，过滤或离心分离细胞质壁未分离；细胞破碎率高，完整细胞数量少
        • 酶解法：利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体，分离具有代谢活性的细胞 能降解细胞壁，必须对细胞给予渗透压保护
      • 愈伤组织
        • 诱导过程：配制半固体诱导培养基，灭菌、植入外植体，1～3周后继代培养
        • 首先, 伤口产生了一个物理屏障,阻止离体组织和母体之间的物质交流(比如激素、糖 类、代谢产物等). 其次, 伤口还释放了很多信号, 用于提醒离体组织调动再生程序.
      • 原生质体
        • 一般采用酶解法分离原生质体，使用纤维素酶和果胶酶混合物
        • 保持溶液的高渗状态：防止原生质体胀裂 渗透压稳定剂：糖、盐、甘露醇、山梨醇等
    • 悬浮培养
      • 将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法 悬浮培养的细胞一般来源于愈伤组织，选择较松散的为宜
    • 产物分离纯化
  • 培养基
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  • 培养条件
    • 温度：室温范围（25 ℃左右），最适产酶温度和最适生长温度不同
    • pH：微酸性（pH 5～6）；细胞培养时，pH一般变化不大
    • 溶解氧：植物细胞需氧量不高，供氧不宜过量；对剪切力敏感，通风搅拌不宜太剧烈
    • 光照：光照对植物细胞的生长和产物合成具有重要影响；光照有时也抑制产物合成
    • 添加前体：处于目的代谢物代谢途径上游的物质；添加前体相对于添加了反应的底物
    • 刺激剂（elector）：引导物质朝特定的代谢方向进行，强化次级代谢产物的生物合成；常用微生物细胞壁碎片和胞外酶