细胞破碎

生物制品分离工程第二章细胞破碎，知识点有细胞破碎的概述、机械法、非机械法、胞内产物的选择性释放等方面。

细胞破碎

• 机械法
  • 机械法破碎特点
    • 处理量大，破碎快，时间短，效率较高，工业规模的重要手段
    • 作用力：挤压，剪切和撞击作用
    • 在许多情况下，细胞内含物全部释放出来
    • 由于机械搅拌产生热量，破碎要采用冷却措施
  • 方法
    • 高压匀浆法
      • 原理：细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。
      • 影响因素： 1、压力、温度和通过匀浆器阀的次数，操作压力影响最大。工业生产中常采用的压力为55－70Mpa。 2、不同菌种，不同生长期以及不同培养条件。
      • 优点： 1、操作参数少，且易于确定； 2、样品损失量少，在间歇处理少量样品方面效果好
      • 适用范围： 1、微生物细胞和植物细胞的大规模破碎； 2、细胞浓度可达20%； 3、团状或丝状真菌易造成堵塞，一些易损伤匀浆阀，质地坚硬的亚细胞器一般不适用； 4、较小的革兰氏阳性菌； 5、含有包含体的基因工程菌 （因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）
    • 珠磨破碎法
      • 原理：细胞悬浮液与玻璃珠（或石英砂，或氧化铝，直径<1mm）一起高速搅拌，研磨使细胞达到某种程度破碎
      • 优点： 1、操作简便稳定，破碎率可控制，易放大 2、在实验室和工业规模上已得到应用 3、适用于绝大多数微生物细胞破碎，特别对于有大量菌丝体的微生物和一些有亚细胞器（质地坚硬）的微生物细胞。
      • 缺点：破碎过程产生大量的热能，有效能量利用率仅为1%，应充分考虑换热
    • 撞击破碎法
      • 原理：将细胞冷冻(-25℃至-30℃) 使其成为刚性球体，可降低破碎的难度
      • 特点
        • 1、细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬间，细胞破碎均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎的现象。 2、细胞破碎程度可通过无级调节载气压力 (流速)控制，避免细胞内部结构的破坏，适用于细胞器 (如线粒体、叶绿体等)的回收。 3、适用于大多数微生物细胞和植物细胞的破碎，通常处理细胞悬浮液浓度为10%-20%。 4、实验室规模的撞击破碎器间歇处理能力约50-500cm3，而工业规模的连续处理在l0dm3/h以上.
    • 超声波破碎法
      • 超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。
      • 超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好
      • 超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关
      • 适用范围
        • 超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低。 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。
• 非机械法
  • 化学试剂破碎法
    • 优点
      • 对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。
    • 缺点
      • 通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50% 有些化学试剂有毒
  • 酶溶法
    • 外加酶法
      • 优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整
      • 缺点
        • 溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。 在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。
    • 自溶法
      • 诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法
      • 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、缓冲液浓度和细胞代谢途径等
      • 缺点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降
  • 物理破碎方法
    • 渗透压冲击法
      • 原理：将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速通过细胞壁和细胞膜进入细胞，引起细胞壁和膜膨胀破裂，从而使细胞通透性增大。
      • 特点： 1、最温和的一种方法 2、选择性高，释放速度快，工艺简单，易放大。 3、适用于易破碎的细胞，和细胞壁预先受到酶处理的细胞，及合成受抑制而强度减弱的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌。
      • 缺点：存在着高盐浓度对产品污染问题
    • 冻融法
      • 将细胞放在低温下突然冷冻,后置于室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。
      • 缺点：适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次;在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
      • 子主题
• 胞内产物的选择性释放
  • 细胞完全破碎的缺点：所有胞内的蛋白质全部释放出来，粘度增加，杂质增加，给后面分离纯化带来困难
  • 目标：细胞不完全破碎，选择性释放，其他物质尽量少释放，粗分
  • 原因：例如利用珠磨法破碎酵母细胞时，各种酶的释放速度不同，靠近细胞膜和细胞壁的酶先释放，细胞内部或细胞器内后释放
  • 问题关键：了解目标产物的性质及其所在位置
  • 原则
    • 破坏或破碎存在目标产物的位置
    • 选择性溶解目标产物
  • 选择破碎方法的依据
    • 处理量的大小
    • 细胞壁的强度和结构
    • 目标产物对破碎条件的敏感性
    • 破碎后固－液分离的难易程度
• 概述
  • 细胞破碎就是采用物理、化学的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。
  • 细胞壁结构对破碎的影响
    • 微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜
    • 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁
    • 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同
  • 细胞破碎的阻力
    • 细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大
    • 酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度
    • 霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构
    • 成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁
  • 不同细胞破碎的难易程度
    • 植物细胞＞真菌（如酵母菌）＞革兰氏阳性细菌＞革兰氏阴性细菌＞动物细胞
  • 破碎细胞的目的
    • 使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏 (增大通透性)或破碎，释放其中的目标产物
  • 影响破碎的因素
    • 细胞的大小、形状
    • 细胞壁的厚度
    • 聚合物的交联程度
  • 细胞破碎方法
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