细胞工程制药

细胞永生化，包含了端粒酶是由RNA和蛋白质组成的复合体,为一种特殊的DNA 聚合酶,合成DNA到染色体末端,因而被认为是一种依赖自身RNA 的逆转录酶。在体外培养的正常体细胞中, 端粒长度逐渐缩短,细胞克隆将面临增殖危机和死亡, 但这种细胞的端粒酶一旦被激活, 将维持端粒缩短和延长的动态平衡,从而使细胞获得无限增殖的能力, 使之永生或癌变。

细胞工程制药

• 细胞永生化和细胞工程
  • 用鸡胚来生产流感疫苗
    • 毒株培育
    • 选胚
    • 接种
    • 培养
    • 收获
    • 纯化及裂解
    • 质控
    • 分装
  • 细胞永生化
    • 概念
      • 是指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离, 从而具有无限增殖能力的过程
    • Hay flick界限
      • 体外培养的细胞，不是不死的，而是有一定寿命的，其增殖不是无限的，而是有一定界限，这个界限称为Hay flick界限
    • 在体外培养的人正常细胞, 经一段时间的分裂, 就会进入一种生长抑制状态, 即衰老期( M1期)。大多数真核生物细胞(生殖细胞、 干细胞除外)都具有这种特性。 经转化了的细胞可越过衰老期而进入另一增殖抑制状态,即危机期( M2期) ,危机期的细胞开始出现退化, 并逐渐死亡。 只有少数细胞在一定因素的影响下, 端粒酶被激活, 以自身RNA为模板合成端粒DNA 来补充或延长端粒,恢复染色体的稳定性,从而使细胞越过危机期,发生了永生化。
    • 由于永生化细胞具有可以多次传代的这一特性, 我们可以利用各种细胞永生化的方法使那些传代困难、 增殖慢、 易衰老的细胞获得永生,从而为我们提供更多的细胞资源。
    • HPV感染使上皮细胞恶性转化-获得永生化能力
      • 病毒携带的原癌基因表达是细胞永生化的原因之一
    • 获得细胞永生的基本方法
      • 病毒感染
      • 过表达端粒酶
        • 端粒酶是由RNA和蛋白质组成的复合体,为一种特殊的DNA 聚合酶,合成DNA到染色体末端,因而被认为是一种依赖自身RNA 的逆转录酶。在体外培养的正常体细胞中, 端粒长度逐渐缩短,细胞克隆将面临增殖危机和死亡, 但这种细胞的端粒酶一旦被激活, 将维持端粒缩短和延长的动态平衡,从而使细胞获得无限增殖的能力, 使之永生或癌变。
      • 细胞永生化最常用的方法就是通过构建含端粒酶催化亚基( hTERT )的表达载体, 通过各种方法转染细胞并进行筛选
      • 磷酸钙法、电穿孔以及逆转录病毒载体法
      • 其中病毒载体感染应用最为广泛
  • 动物细胞生产促红细胞生成素
    • CHO细胞生产EPO的优势
      • 准确的翻译后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子
      • 表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力
      • 贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到1000L以上
      • 很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化
    • 步骤
    • EPO生产的创新-利用家畜生物反应器
      • 优势：生产成本低，表达产物生物活性好，产量高