重组DNA技术的基本工具

重组DNA技术的基本工具：包含了分子手术刀、分子缝合针、分子运输车：基因进入受体细胞的载体等内容。

重组DVA技术的基本工具

• 分子手术刀
  • 限制性内切核酸酶
    • 主要从原核生物中分离纯化
      • 在原核生物中的作用为：切割外来的DNA以保护自己
    • 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二脂键断开（催化）
    • 识别序列大多由六个核苷酸组成，也有四个、八个或其他数量
      • 核苷酸的组成：五碳糖，磷酸，含N碱基
    • 形式有两种
      • 粘性末端
        • 切割完后有两个游离的磷酸
      • 平末端
• 分子缝合针
  • DNA连接酶
    • 从大肠杆菌中分离得到----E.coliDNA连接酶
      • 只能连接粘性末端
    • T4噬菌体中分离得到----T4DNA连接酶
      • 粘性末端
      • 平末端（效率低）
      • 都是连接互补的DNA
• 分子运输车
  • 基因进入受体细胞的载体
    • 噬菌体（专一寄生）、动植物病毒
    • 质粒（常用）
      • 定义：是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子
      • 特点
        • 具有自我复制能力的环状双链DNA分子
        • 有一个至多个限制酶切割位点
        • 常有特殊的标记基因
          • 四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因
            • 用于重组DNA的鉴定和选择
• 酶的特点：专一，高效，作用条件温和
• 聚合酶
  • 连接单个核酸（有模板）
  • 只形成一条链
  • 用于DNA复制
• 连接酶
  • 连接DNA片段
  • 用于基因工程
• DNA的粗提取与鉴定（从许多大分子物质中获得）
  • 利用差异
    • DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
    • DNA在不同浓度的NaCl中溶解度不同
      • 溶于2摩尔的，0.14摩尔时最低
    • 一定温度下DNA遇二苯胺试剂会呈蓝色（用于鉴定）
  • 材料
    • 洋葱等植物、猪肝
      • 哺乳动物的红细胞不可——没有DNA
    • 体积分数为95的酒精
    • 研磨液、蒸馏水、二苯胺试剂
  • 操作
    • 放置4摄氏度\离心管，取上清液
    • 获取
      • 在上清液中加入等体积预冷的酒精，后用玻璃棒沿一个方向搅出白色丝状物
      • 或用离心管，弃上清液取沉淀物
    • 鉴定
      • 两根氯化钠，都加二苯胺，看其中一根是否变蓝
• 大分子物质：DNA\RNA、蛋白质、脂质、部分糖类