细胞工程第二部分

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细胞工程第二部分

• 细胞全能性及其表达
  • 细胞全能性的表达
    • 一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处的位置和生理状态
    • 前提
      • 生理脱离
      • 激素调控
    • 细胞脱分化
      • 概念：离体培养条件下使已分化的植物细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程
      • 静止细胞启动细胞分裂是分化细胞脱分化成功的重要标志
      • 质体转变为原质体（前质体）和液泡发育成蛋白体 被认为是细胞脱分化的重要特征
      • 启动阶段
        • 胞质增生
        • 伸出细胞质丝
        • 液泡蛋白体出现
      • 演变阶段
        • 原质体形成
        • 细胞器增多
      • 终结阶段
        • 蛋白质合成达到顶峰
        • 细胞分裂即将开始
      • 调控
        • 细胞周期的调控
          • 细胞脱分化调控的实质是G0期细胞回复到细胞分裂周期的过程
          • 调控因子
            • 细胞周期蛋白(cyclin)
            • 依赖周期蛋白激酶(CDK）
            • 依赖周期蛋白抑制子(CKI)
        • 激素诱导基因表达的调控
          • 生长素感应：激活的受体可能引起某些特定的反应，如某些离子的吸收或释放、特定蛋白的磷酸化或去磷酸化
          • 植物磺肽素可能介导了与生长素和细胞分裂素相关的信号传导
      • 脱分化与愈伤组织形成
        • 细胞学变化；标志：出现液泡蛋白体；质体转换；核移向中央
        • 愈伤组织：脱分化的细胞，经过细胞分裂，产生的无组织结构，无明显极性的，松散的细胞团，称为愈伤组织(callus，calli)
        • 褐化现象
        • 优良愈伤组织
          • 满足特征
            • 高度的胚性或再分化能力
            • 容易散碎
            • 旺盛的自我增殖能力
            • 经长期继代保存而不丧失胚性
          • 获得
            • 选择适当的基因型和适当的外植体
            • 正确的激素配比
            • 采取某些特殊的理化因素改变培养条件
        • 继代培养
          • 定期把愈伤组织或其它培养材料转移到新鲜的相同培养基上培养
          • 原因
            • 水分或营养的损失
            • 代谢产物积累
            • pH 值发生改变
          • 最佳时期：即将达到顶峰之前
          • 出现遗传不稳定性和变异性
    • 细胞分化与再分化
      • （differentiation）是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程
      • 极性
        • （polarity）是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异
        • 在低等植物或高等植物中均普遍存在
        • 没有极性就没有分化
        • 一般情况下不可逆转
        • 细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志
      • TEs（管状分子）细胞
        • 功能
          • 水分和营养物质运输
          • 生物与环境信息传递
          • 机械支撑
        • 离体培养中TEs 细胞的出现是组织分化的标志
      • 激素与细胞分化
        • 生长素和细胞分裂素是主要激素
        • 植物激素的种类及生理功能
        • 生长素与细胞分裂素量与比值的不同配合对细胞分化起着重要的调节作用
      • 再分化
        • (Redifferentiation) ，即脱分化后的细胞在特定条件下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或者经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整植株，这一过程称为细胞再分化
        • 诱导期：静止细胞 ——分生状态
        • 分裂期：细胞开始分裂——持续分裂
        • 分化期：愈伤组织形成——形成器官原基
        • 影响细胞脱分化和再分化的因素
          • 生理或机械隔离
          • 外植体来源和种类
          • 生长调节剂的影响
  • 细胞全能性的概述
    • 概念
      • 细胞全能性(cell totipotency) ，一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力称之为细胞的全能性
      • 植物细胞全能性 (plant cell totipotency) ：是指植物体的每个活细胞都具有该植物的全套遗传信息，与合子一样具备有发育成完整植株的潜能
    • 细胞全能性的相对性
      • 动、植物细胞全能性的表现程度存在明显差异
      • 不是任何植物细胞均可以直接产生植物个体
      • 再生潜力与其分化程度呈负相关
      • 极少数完全丧失分化能力的细胞，不能恢复其细胞全能性
    • 植物细胞全能性的实现
      • A 循环（生命周期）：孢子体（二倍体）和配子体（单倍体）的世代交替
      • B 循环（细胞周期）
        • DNA复制
        • mRNA转录
        • 蛋白质合成
      • C 循环（组织培养周期）：脱分化及再分化
      • 细胞周期是基础，DNA重组技术是纽带，生命周期是实现途径
      • 植物细胞按分裂能力分类
        • 周期细胞，始终保持分裂能力
        • 终端分化细胞（特化细胞），永久失去分裂能力
        • G0细胞，受到外界刺激后可重新启动分裂
• 脱病毒植物的培养
  • 植物脱毒的意义
    • 增加产量
    • 提高质量
    • 利于种质资源的保存
  • 植物脱毒的原理
    • 能量竞争
    • 传导抑制：病毒的移动主要有两条途径，其一是维管组织，而分生组织中不存在维管系统；其二是胞间连丝，但病毒在这条途径中的移动速度很慢，难以追上活跃生长的茎尖
    • 激素抑制：高水平的内源激素，可以阻滞病毒的侵入或抑制病毒的增殖
    • 抑制因子：在分生组织中的活性应最高，因而分生组织不受侵染
    • 酶缺乏：在分生组织中缺乏或尚未建立病毒复制所需的酶系统
  • 茎尖培养脱病毒的技术规程
    • 一般过程
      • 诊断—病毒的种类
      • 脱毒—脱毒方法
      • 鉴定—多数再生植株仍然带病
      • 繁殖—繁殖方法和防止病毒再侵染的措施，对再次繁殖的植株进行检测
    • 技术
      • 待脱毒植物所带病毒的诊断
      • 母体材料的选择及高温预处理
        • 品种要可靠；选择经当地栽培确定的高产优质品种；名贵稀有的植物良种
        • 预处理基本原理：植物细胞比病毒耐高温；目的：扩大免疫区
      • 茎尖分生组织培养再生植株
        • 流程：外植体消毒—茎尖剥离—茎尖培养—形成植株—生根移栽
        • 茎尖剥离是关键：消毒彻底、去掉叶片（剥离出圆滑的生长锥，需要迅速准确）
      • 热处理与茎尖培养相结合脱毒
        • 只用热处理：所用的时间长，植株易死亡，且脱毒率不高
        • 只用茎尖培养：需在解剖镜下切取很短的茎尖，操作和培养都很 困难，且脱毒率低
        • 方法：切取0.5mm长的茎尖培养成试管苗后，再将试管苗进行热处理
        • 组培苗在密封的环境中，能适应高温，可省去根部保护的麻烦操作，植株成活率及脱毒率均较高
      • 脱毒效果检测
        • 指示植物法
          • 利用病毒在指示植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类和数量的标准
          • 优点：条件简单；操作方便。 局限：只能用来鉴定靠汁液传染的病毒
          • 汁液接种法，嫁接接种法
        • 抗血清鉴定法
          • 原理：免疫沉淀反应
          • 特异性高，测定速度快
        • 电子显微镜检查法
        • 分子生物学检测法（核酸杂交技术，PCR技术等）
  • 影响脱毒效果的因素
    • 茎尖大小：外植体应小到足以能脱除病毒；大到足以能发育成一个完整植株。一般茎尖最好带1～2个叶原基
    • 外植体生理状态
      • 茎尖最好由活跃生长的芽上切取
      • 顶芽的脱毒效果比侧芽好
      • 生长旺盛季节的芽比休眠芽脱毒效果好
    • 母体材料病毒侵染程度：单一病毒感染的植株脱毒较容易，复合感染的植株脱毒较难
• 植物离体快速繁殖
  • 植物繁殖方式
    • 孢子繁殖
    • 种子繁殖
    • 无性生殖，通过无性繁殖产生的一个群体称为一个克隆(无性系)
  • 概念和意义
    • 离体快速繁殖（In vitro rapid propagation）是指利用植物组织培养技术，在离体条件下对植物进行营养繁殖
    • 用于自然繁殖极易感染病毒的植物
    • 用于加速某些难繁殖或繁殖速度很低的植物
    • 用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不易无性繁殖的植物
  • 离体无性繁殖中的形态建成方式
    • 芽增殖型
      • 定义：选取已经发育成熟的腋芽或顶芽，连同它们的短枝经表面消毒后，在无菌条件下培养，诱导芽伸长或长成芽丛，并使其生根形成植株的方式
      • 选材：具腋芽或顶芽的短枝
      • 技术关键：打破顶端优势，促进腋芽增殖
      • 特点
        • 繁殖效率高
        • 培养方法简单，能够保持该物种的遗传稳定性，长期继代繁殖
        • 缩短童龄（营养生长）期
        • 不需添加外源激素
    • 不定芽型
      • 定义：从外植体诱导直接产生不定芽，再生植株的方式
      • 选材：外植体可以是充分发育的各种器官
      • 技术关键：对培养基要求高，控制激素浓度，避免愈伤组织发生
      • 特点：遗传性状较稳定；繁殖率非常高；繁殖速度一般
    • 器官发生型
      • 定义：从器官外植体诱导愈伤组织，经愈伤组织细胞的分化再生成植株的方式
      • 技术关键：愈伤组织尽量来源一致；不宜反复继代；分化过程也要严格挑选，使试管苗整齐一致
      • 特点：繁殖速度较快；遗传性状不稳定； 愈伤组织是进行遗传转化、细胞或原生质体培养的好材料
    • 胚状体发生型
      • 定义：由植物器官、组织和细胞培养而形成胚状体结构，最后以胚状体萌发成苗的方式
      • 技术关键：提高胚状体发生率及萌发率；提高胚状体同步化率
      • 特点：双极性，数量多，遗传性一致，有些植物体细胞发生数量大
    • 原球茎型：兰属特有器官发生方式
  • 离体无性繁殖过程
    • 三个条件
      • 无性系稳定、再生力强
      • 能形成大量的完整小植株
      • 田间移栽技术成熟，成活率高
    • 四个阶段
      • 建立无菌培养物
      • 繁殖体增殖
      • 诱导生根
      • 无菌条件下
      • 移栽于土壤中——温室中
    • 外植体的选择
      • 草本 ＞木本 双子叶 ＞单子叶
      • 生长期的幼嫩部分好，尤其顶芽
      • 外植体过大，灭菌难，易于污染；过小，难于成活（通常1.0cm左右）
      • 在生长开始的季节采样 生长末期或处于休眠时期则不利于培养
      • 外植体生理状态和发育年龄
    • 外植体的灭菌（消毒剂选择）
      • 良好的灭菌效果
      • 易清除或能自行分解
      • 对材料损伤程度小
    • 器官培养技术
    • 无菌苗的增殖
      • 增殖方法：诱导形成大量丛生芽
      • 腋芽增殖：原理——解除顶端优势
      • 主要影响因素
        • 激素：细胞分裂素抑制顶端优势，促进腋芽生长发育
        • 营养条件：与初代培养相比无机盐浓度增加
        • 光照及温度条件：2000～3000Lux持续12～16h/d，20~25℃
    • 无菌苗生根
      • 措施：去除细胞分裂素，补加适当的生长素
      • 影响因素
        • 无机盐的浓度
        • 生长素的种类和浓度
        • 继代培养时间
        • 光照和温度条件
      • 生根方法：在培养瓶中（试管内）诱导生根试管苗直接扦插，在土壤中生根
    • 试管苗的移栽
  • 再生植株的鉴定
    • 细胞学鉴定：对再生植株群体进行抽样，检测其根尖染色体数目以及减数分裂期染色体行为
    • 形态学鉴定：田间鉴定再生植株植物学性状，发现与其亲本不同的变异株时应再进行细胞学鉴定
  • 遗传与变异控制
    • 变异原因
      • 外源生长调节剂
      • 继代次数与变异
      • 增殖方式的合理选择
      • 增殖方式的合理选择
    • 难题
      • 污染：选择嫩梢、新芽或胚作为外植体材料，对外植体进行彻底消毒
      • 褐变
        • 选择生长处于旺盛的外植体
        • 调整无机盐成分、植物激素水平、适宜温度、及时继代培养
        • 连续转移
        • 半胱氨酸、Vc、PVP、柠檬酸等抗氧化剂
        • 0.1%～0.5%的活性炭
      • 玻璃化
        • 主要是适应性的生理问题，不能很好适应培养基和培养环境的结果。如容器中水汽饱和，透气性差
        • 氮源：特别降低NH4+浓度，提高NO3-含量
        • 蔗糖与琼脂：适当提高培养基中蔗糖和琼脂浓度
        • 激素：降低cytokinin和GA3浓度，增加auxin浓度,加入少量脱落酸
        • 光照：增加自然光照，控制光照时间
        • 温度：降低培养温度，进行变温培养
        • 通气：增加容器通风，棉塞或通气好的封口膜封口