核酸的分离纯化

核酸分离纯化思维导图：包含DNA的分离与纯化，基因组DNA的分离与纯化，质粒DNA的分离与纯化，DNA的鉴定，DNA的保存，RNA的分离与纯化，RNA提取的特殊要求等等

核酸分离纯化

• DNA的分离与纯化
  • 基因组DNA的分离与纯化
    • 酚-氯仿抽提法
      • 是利用苯酚为蛋白质的变性剂，反复抽提使蛋白质变性，十二烷基磺酸( SDS ）将细胞膜裂解，在蛋白酶 K 和乙二胺四乙酸（ EDTA ）存在下消化蛋白质、多肽及小肽分子，变性降解核蛋白，使 DNA 从核蛋白中游离出来， DNA 易溶于水，不溶于有机溶剂。
      • 酚可以使蛋白质变性沉淀，并抑制 DNA 酶的活性。
      • 氯仿有助于水相与有机相分离和除去溶液中的酚。
      • SDS 为生物阴离子去垢剂，主要引起细胞膜的降解，并能乳化脂质和蛋白质，使它们沉淀，同时还有降解 DNA 酶的作用。
      • 蛋白酶K则有水解蛋白质的作用，可以消化 DNA 酶、 DNA 上的蛋白质，也有裂解细胞的作用。
      • EDTA 为二价金属离子螯合剂，可以抑制 DNA了酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性。
    • 吸附柱法
      • 是在离心柱内使用一种特殊的硅基质滤膜，可以选择性吸附 DNA 片段，而 RNA 、蛋白质和其他杂质不会被吸附。
    • 磁珠法
      • 是采用了纳米级磁珠，这种磁珠表面标记了对 DNA 有吸附作用的特定活性官能基团，能同 DNA 发生吸附反应，通过洗涤液洗涤后，加人洗脱液，特定条件下 DNA 释放于洗脱液中。
  • 质粒DNA的分离与纯化
    • 碱裂解法
      • 在强性（ pH 12.0~12.6）条件下，用 SDS 破坏细胞壁，裂解细胞，使宿主细胞的蛋白质与染色槍 DNA 发生变性，双链解开，在高盐条件下形成沉淀。
    • 煮沸裂解法
      • 将细菌悬浮于含 Triton X -100和溶菌酶的缓冲液中，加热至100℃使其裂解，当温度下降后，质粒 DNA 重新恢复其超螺旋结构。
    • SDS裂解法
      • 将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和 EDTA 处理破坏细胞壁，破壁细菌再用 SDS 裂解，菌体染色体 DN缠绕附着在细胞壁碎片上，离心后沉淀下来，从而温和地释放质粒 DNA 到等渗液中，然后用酚﹣氯仿抽提。
  • DNA的鉴定
    • DNA浓度的鉴定
      • 紫外分光光度法
        • Aso =1时， A 双链 DNA 的含量大约相当于50ug/ ml ，单链 DNA 的含量为40ug/ ml ，单链寡聚核苷酸的含量为33pg/ ml 。
      • 荧光光度法
        • 荧光染料溴化乙锭 能嵌人核酸碱基平面，形成荧光配合物，在254~36Snm波长紫外线激发下，发出橙红色荧光，而且荧光强度与核酸含量呈正比。
    • DNA纯度的鉴定
      • 紫外分光光度法
        • 通过 Azwo 与 Agw 的比值来判定 DNA 中是否有 RNA 、蛋白质或具他杂质的污染。纯 DNA 的 AzcoApxo 比值为1.8，比值升高与降低均表示不纯。
      • 荧光光度法
        • 用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。 此法可以鉴定 DNA 制品中有无 RNA 的污染。
      • DNA完整性的鉴定
        • DNA 分子完整性的鉴定通常采用凝胶电泳法。
  • DNA的保存
    • DNA 样品溶于 pH 8.0的 TE 缓冲液中，-20℃可保存2年，-70℃可以保存数年。
• RNA的分离与纯化
  • RNA提取的特殊要求
    • 在进行 RNA的操作过程中需要操作者倾戴一次性手套和口罩。
    • 玻璃器皿置于200℃烘箱中烘烤2小时以上。
    • 不能高温烘烤的材料可用0.1％的焦碳酸二乙酯 水溶液处理。
    • 为了避免RNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上所有器皿一律经烷化处理。
    • 实验所用试剂也可用 DEPC 水溶液处理，加人 DEPC 全0.1%，置于37℃水浴箱过夜，高压灭菌以消除残存的 DEPC 。若配制的溶液不能高压灭菌，可用 DEPC 水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。
  • RNA的分离与纯化技术
    • 总RNA的分离与纯化
      • Trizol试剂法
        • Tnizol 含酚和异硫氰酸胍等成分，可以裂解组织或细胞并且灭活核酸酶，使 RNA 释放出来，同时保护RNA 的完整性。
        • 该法具有适用范围广、操作简便、纯度高、污染小的特点。
      • 离心柱法
        • 利用裂解液促便细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来；释放出的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力，对其他生化成分如蛋白质、多糖、脂类则基本不吸附；把吸附在特异载体上的核酸用洗脱液洗脱下来，分离得到纯化的总 RNA 。
      • 磁珠法
        • 磁珠能与 RNA 分子特异性地识别和高效结合。利用该纳米微球的超顺磁性，在一定条件下，对 RNA 具有极强的富集能力，当条件改变时可逆地释放 RNA 。
        • 磁珠法具有高质量、高产量、高通量，操作简单快速，无毒无害的特点。
    • mRNA的分离分纯化
      • 寡聚（dT）-纤维素柱层析法
        • mRNA 上的 polyA 可与具有 OligoT的纤维素柱在高盐条件下碱基配对发生亲和吸附， 在低盐条件下，碱基配对被破坏，吸附解除，而其他成分的 RNA 则不具这一符性。
      • 磁珠法
        • 此法可从组织细胞中快速分离纯化带有 PolyA 的 mRNA ，方法简单迅速， mRNA 不易降解。此外，很多生物技术公司研发出无须以总 RNA 为原始材料，直接从标本中提取 mRNA 的试剂盒，更加方便快捷。
  • RNA的鉴定
    • RNA浓度的鉴定
      • 紫外分光光度法
        • 通过测定260nm波长处吸光度值的变化来计算 RNA 样品的浓度， A260 = 1 时，单链 RNA 的含量为40ug/ ml。
      • 荧光光度法
        • RNA 溶液中加入 EB ，形成荧光配合物，在254~365nm波长紫外线激发下， 发出橙红色荧光，而且荧光强度与核酸含量呈正比。
    • RNA纯度的鉴定
      • 紫外线分光光度法
        • A260/ A280 的比值是衡量蛋白质污染程度的一个良好指标，纯 RNA 的 A260/ A280比值为2.0，是高质量 RNA 的标志；A260/ A280<1.8）表明蛋白质杂质较多； A260 / A280>2.2，表明 RNA 已经降解。
      • 荧光光度法
        • RNA 中以 rRNA 最多，占到80%~85%, tRNA 及核内小分子 RNA 占15%~209% mRA 占1%~5%，故总 RNA 电泳后可呈现特征性的三条带。
        • 原核生物为明显可见的23s,16S RNA 条带及由5S的 rRNA 与 RNA 组成的相对有些扩散的快迁移条带；
        • 真核生物为28S、18S的 r RNA 及由5S、5.8S的 rRNA 和 RNA 构成条带。
    • RNA完整性的鉴定
      • 采用凝胶电泳法
      • 沉降糸数大，分子量大，电泳迁移率低，荧光强度积分高。
      • 沉降糸数小，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。
  • RNA的保存
    • 可将 RNA 溶 0.3mol/ L 的醋酸钠溶液或 蒸消毒水中，-70℃保存。
    • DEPC 水溶解 RNA 或者在 RNA 溶液中加人 RNA 酶阻抑蛋白 或 VRC ．可延长保存时间。
    • RNA 沉淀于70％的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可于﹣20C长期保存。